14-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在成人其發(fā)生率約占顱內(nèi)腫瘤的一半。該類腫瘤患者中的大部分即使手術(shù)后接受放療、化療等綜合治療，療效依然欠佳。其中，惡性程度最高的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者經(jīng)綜合治療后，其中位數(shù)生存期也僅為1年。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中有多種基因的連鎖改變，這些改變最終使腫瘤細(xì)胞獲得無限增值的生長優(yōu)勢，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤細(xì)胞獲得對抗細(xì)胞調(diào)亡的能力是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，發(fā)現(xiàn)和闡明瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞調(diào)亡的機(jī)制有助于研

2、究腫瘤治療的新方法。 14-3-3蛋白是一類高度保守的小分子多功能酸性二聚體蛋白。它們是在1967年一項(xiàng)有關(guān)腦蛋白的研究中被發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)其在隨后的蛋白電泳中的位置而命名的。最初只發(fā)現(xiàn)這類蛋白在神經(jīng)元中有大量的表達(dá)，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)它們存在于所有真核生物體中。目前，已發(fā)現(xiàn)這類蛋白在哺乳類有機(jī)體中有由不同基因編碼的7個(gè)亞型及200多個(gè)能與其相互結(jié)合的配體分子。研究還發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在多種細(xì)胞生理過程中起重要作用。近年的研究還提示

3、，14-3-3有可能通過抑制細(xì)胞調(diào)亡而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，國內(nèi)外尚無14-3-3在膠質(zhì)瘤中表達(dá)情況及作用的研究?；诖耍菊n題從以下三個(gè)方面進(jìn)行了探討。 114-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義：采用免疫組化ABC法檢測了10例正常腦組織、5個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U251、U87、BT325、SHG-44和C6)及118例人腦膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本中14-3-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，14-3-3蛋白主要表達(dá)于正常腦組織中的神經(jīng)

4、元胞體和突起，在幾類神經(jīng)元中有強(qiáng)表達(dá)。而絕大部分膠質(zhì)細(xì)胞中無14-3-3蛋白的表達(dá)，僅在極少量的膠質(zhì)細(xì)胞中可見其弱陽性表達(dá)。5株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均可見14-3-3蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)。絕大部分星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中可見14-3-3蛋白的陽性表達(dá)，其表達(dá)情況為：Ⅰ級78.6％(11/14)，Ⅱ級76.5％(13/17)，Ⅲ級76.2％(16/21)，Ⅳ級79.3％(23/29)。在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級3個(gè)不同惡性級別的星形細(xì)胞腫瘤中，14-3-3蛋白的陽性表

5、達(dá)率無顯著差別(P=-0.958)，但14-3-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度(SI)和范圍(PP)有隨腫瘤的惡性度增高而增加的趨勢(P=-0.044)。大部分其它類型的膠質(zhì)瘤中也可見14-3-3蛋白的陽性表達(dá)，其表達(dá)情況為：少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤66.7％(4/6)，間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤100％(4/4)，室管膜瘤50％(2/4)，間變型室管膜瘤66.7％(2/3)，脈絡(luò)叢乳頭狀瘤100％(5/5)，松果體瘤100％(3/3)，和髓母細(xì)胞瘤66.7％(8/

6、12)。結(jié)果提示14-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中有大量的表達(dá)，其上調(diào)表達(dá)與彌漫侵潤性星形細(xì)胞瘤的惡性程度相關(guān)。14-3-3蛋白表達(dá)上調(diào)可能是大多數(shù)膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞凋亡的有效方式，因此，14-3-3蛋白有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。 2Difopein抑制14-3-3蛋白和其配體分子的結(jié)合對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖以及凋亡的影響：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將含特異性14-3-3蛋白拮抗劑Difopein(di

7、mericfourteen-three-threepeptideinhibitor)的質(zhì)粒pSCM138(difopein/pEYFP-C1)和對照質(zhì)粒pEYFP-C1(不含Difopein)轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞。通過免疫共沉淀、Westernblot、激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、DNALadder、TUNEL染色、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)以及Caspase-3檢測定性和定量研究了Difopein抑制14-3-3蛋白和其配體分

8、子的結(jié)合對U251體外細(xì)胞凋亡的影響。并通過FCM對Difopein和順鉑(Cisplatin)協(xié)同作用于U251細(xì)胞的效果進(jìn)行了檢測。免疫共沉淀檢測證實(shí)difopein能與U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的14-3-3蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、DNALadder和TUNEL染色顯示，與U251、轉(zhuǎn)染pEYFP-C1的U251細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細(xì)胞中凋亡細(xì)胞明顯增多。FCM測定細(xì)胞周期顯示，與U251、轉(zhuǎn)染

9、pEYFP-C1的U251細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細(xì)胞G1期細(xì)胞明顯增多，S期和G2期細(xì)胞明顯減少。FCM定量分析凋亡細(xì)胞顯示，與U251(1.0％)、轉(zhuǎn)染pEYFP-C1的U251(2.0％)細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細(xì)胞凋亡細(xì)胞增加約6～11倍(24h達(dá)12.0％,48h達(dá)21.5％)。Caspase-3檢測也顯示，與U251、轉(zhuǎn)染pEYFP-C1的U251細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細(xì)胞中Cas

10、pase-3的活性明顯增加(P＜0.01)。FCM檢測Difopein和順鉑協(xié)同作用的效果證實(shí)，Difopein能顯著的增加U251細(xì)胞對順鉑的敏感性。上述研究結(jié)果提示：①difopein能與U251細(xì)胞中的14-3-3蛋白結(jié)合來抑制14-3-3與其它蛋白之間相互作用，從而促進(jìn)U251瘤細(xì)胞凋亡，且difopein誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的過程不依賴p53基因的參與；②difopein能通過阻斷14-3-3與其它蛋白之間相互作用而增強(qiáng)U25

11、1細(xì)胞對順鉑的敏感性；③以14-3-3蛋白為靶點(diǎn)來設(shè)計(jì)新的腦膠質(zhì)瘤治療方法是可行的。 3Difopein抑制14-3-3蛋白和其配體分子的結(jié)合對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠成瘤性的影響：通過PCR從pSCM138(difopein/pEYFP-C1)質(zhì)粒中獲得了全序列EYFP和EYFP-Difopein基因，將用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切的EYFP和EYFP-difopein片段插入到用BamHⅠ酶切后的pGfa2-LacZ載體，隨后將得

12、到的重組質(zhì)粒用BglⅡ酶切后回收的大片段插入到用BamHⅠ和ClaⅠ雙酶切后的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX，從而成功地構(gòu)建了Gfa2啟動(dòng)子控制下表達(dá)EYFP和EYFP-Difopein基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-Gfa2-EYFP和pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein。結(jié)果顯示，pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein和pLNCX-Gfa2-EYFP能在表達(dá)GFAP蛋白的U251細(xì)胞中特異性地表達(dá)EYFP-difop

13、ein和EYFP基因mRNA及蛋白，而在不表達(dá)GFAP的NIH-3T3中EYFP-difopein或EYFP基因mRNA及蛋白均無表達(dá)。這說明我們所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gfa2啟動(dòng)子的確能控制目的基因在星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的膠質(zhì)瘤中的特異性表達(dá)。我們構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein和pLNCX-Gfa2-EYFP在基因靶向治療中具有雙重保險(xiǎn)作用：第一在感染水平上，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只感染分裂的細(xì)胞而不感染

14、未分裂的細(xì)胞，與未分裂的正常細(xì)胞相比腫瘤細(xì)胞具有更加旺盛的分裂能力，因此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能有效地感染處于細(xì)胞增殖周期的腫瘤細(xì)胞但不影響處于增殖周期外的靜止細(xì)胞；第二在轉(zhuǎn)錄水平上，gfa2啟動(dòng)子能特異性地啟動(dòng)目的基因(EYFP-difopein基因或EYFP基因)在星形膠質(zhì)細(xì)胞來源腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)而在其它不含GFAP的細(xì)胞中不表達(dá)，這樣就保證了在不影響14-3-3蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它類型細(xì)胞中的正常生理功能的同時(shí)又能有效地阻斷在星形膠質(zhì)細(xì)

15、胞來源腫瘤細(xì)胞中14-3-3蛋白與其配體蛋白的結(jié)合。這為我們進(jìn)一步的裸鼠腫瘤試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 在裸鼠成瘤試驗(yàn)中，我們將U251+GP/EYFP-difopein(轉(zhuǎn)染pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein的GP+E-86包裝細(xì)胞)細(xì)胞(A組)、U251+GP/EYFP(轉(zhuǎn)染pLNCX-Gfa2-EYFP的GP+E-86包裝細(xì)胞)細(xì)胞(B組)和U251細(xì)胞(C組)分別接種于裸鼠背部皮下，建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。

16、定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察6周后處死動(dòng)物，稱瘤重。結(jié)果顯示，與B組和C組裸鼠相比，A組裸鼠腫瘤形成時(shí)間延遲，腫瘤生長緩慢，腫瘤體積及瘤重均明顯減小(P均＜0.01)。免疫組化染色顯示各組腫瘤組織符合多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形態(tài)。Westernblot檢測顯示，與B組和C組相比，A組裸鼠腫瘤組織中活性的Capase-3蛋白明顯上調(diào)。上述結(jié)果提示在裸鼠腫瘤細(xì)胞中difopein可通過抑制14-3-3蛋白和其配體分