Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá).pdf

1、膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)腦膠質(zhì)瘤占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的40-50％。與其他部位常見腫瘤相比，膠質(zhì)瘤發(fā)病率較低。然而，膠質(zhì)瘤卻有著極為不成比例的發(fā)病率和死亡率，目前總體預(yù)后不佳。隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，大量研究發(fā)現(xiàn)人體免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。Nod樣受體(Nod-like receptor，NLR)作為一種胞內(nèi)模式識(shí)別受體，具有識(shí)別入侵病原體和激活先天免疫反應(yīng)的重要功能，是一類細(xì)胞內(nèi)感

2、應(yīng)分子。NLRP3作為NLR家族成員之一，在多種疾病的防御和發(fā)生過程中具有重要作用。NLRP3可以調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的成熟與分泌，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IL-1β和IL-18這兩個(gè)緊密相關(guān)的IL-1家族細(xì)胞因子對(duì)宿主免疫反應(yīng)起著關(guān)鍵調(diào)控因子的作用，同時(shí)在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前NLRP3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及對(duì)于預(yù)后的指導(dǎo)意義報(bào)道較少。
　　 研究目的:
　　 1.研究Nod樣受體熱

3、蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nod-like receptor pyrindomain-containing protein 3，NLRP3)在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。
　　 2.探討NLRP3在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。為治療膠質(zhì)瘤尋找新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 研究對(duì)象及方法:
　　 1.研究對(duì)象
　　 按照2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將所收集的49例人腦膠質(zhì)瘤組織根據(jù)其病理類型

4、分為低級(jí)別組（20例）和高級(jí)別組（29例），并收集腦外傷后行顱內(nèi)減壓手術(shù)切除的正常腦組織10例做對(duì)照。
　　 2.研究方法
　　 2.1、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)法檢測(cè)NLRP3表達(dá)量及組織定位蠟塊包埋組織，3μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟2次，5～10min/次，梯度酒精水化，EDTA抗原修復(fù)液(pH9.0)高壓修復(fù)2min，待組織切片自然冷卻后PBS洗1次。滴加濃度為1∶100的單克隆抗體N

5、LRP3（Ⅰ抗），4℃孵育過夜。PBST洗3次，5min/次，滴加羊抗鼠的Ⅱ抗，37℃孵育45 min，PBST洗3次，5min/次。DAB(1∶50)顯色，蘇木素復(fù)染30sec，中性樹膠封片。正常腦組織切片作為對(duì)照。
　　 2.2、免疫印跡(western blot)法檢測(cè)NLRP3在蛋白水平表達(dá)
　　 從-80℃冰箱中取出正常及膠質(zhì)瘤組織加入裂解液與蛋白酶抑制劑，研磨后超聲震碎，15000×g/min，離心10min

6、，離心半徑13.5cm，4℃，上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，做標(biāo)記，BCA測(cè)定，并調(diào)整蛋白濃度，蛋白樣品中加入1/6體積的蛋白上樣緩沖液，煮沸10min。加樣于配好的SDS凝膠，積層膠90V，進(jìn)入分離膠后110V，切膠，轉(zhuǎn)膜，封閉用1％的BSA，室溫1.5h。一抗孵育，4℃過夜。1×TBST洗10min，重復(fù)3次，二抗(1∶5000)37℃孵育1h，1×TBST洗10min，重復(fù)3次，顯色。
　　 2.3、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

7、反應(yīng)(QRT-PCR)法檢測(cè)NLRP3在mRNA水平表達(dá)
　　 根據(jù)Invitrogen公司Total RNA提取kit說明書完成。紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本的RNA濃度。按照Ferments逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL，逆轉(zhuǎn)錄每個(gè)樣本RNA1μg，引物選擇oligo(dT)1μL，5×Reactin Buffer4μL，10MmdNTP Mix2μL,RibolockTM Rnase Inhibitor1μL,Rev

8、ertAiTMM-MuLV Reverse Transcriptase1μL，RNase-free water(0～11μL).反應(yīng)條件:65℃孵育5min，42℃，60min，70℃5min.QRT-PCR檢測(cè)目的基因及內(nèi)參:反應(yīng)體系為25μL∶(2x)SYBR Green qPCR master mix 12.5μL,Template cDNA 2μL,Forward Primer 1μL,ReversePrimer 1μL，nuc

9、lease-free Water 8.5μL.反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃5min，55℃退火1min，68℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。
　　 研究結(jié)果:
　　 NLRP3在正常腦組織中表達(dá)不明顯，在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)較少，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。人腦膠質(zhì)瘤組織中NLRP3在mRNA水平及蛋白水平均高于正常腦組織(P＜0.01)。NLRP3的表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

10、　　 結(jié)論:
　　 1、人腦膠質(zhì)瘤中存在NLRP3的異常表達(dá)，其表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而增加。
　　 2、NLRP3在人膠質(zhì)瘤的發(fā)生和侵襲中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　 3、檢測(cè)NLRP3的表達(dá)有助于膠質(zhì)瘤分化程度的判斷。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)及意義:
　　 1、本研究首次檢測(cè)了NLRP3在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其隨著腫瘤病理級(jí)別的升高而增加。據(jù)此預(yù)測(cè)其可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮