TLR9在膠質瘤中的表達及其與膠質瘤生物學行為和預后的關系.pdf

1、神經膠質瘤是最常見的腦腫瘤,盡管包括手術切除,放射治療和化學治療在內的綜合治療策略的聯(lián)合應用,高級別神經膠質瘤的預后仍不盡人意,特別是多形性膠質母細胞瘤。多形膠質母細胞瘤是顱內惡性程度最高的惡性腫瘤,占原發(fā)性顱內腫瘤的15-20％。多形膠質母細胞瘤具有細胞異質性、分裂極度活躍、腫瘤微血管增生和壞死的組織病理特點。多形膠質母細胞瘤病人的平均中位生存期只有大約一年,在過去的十年中沒有顯著改善。因此,迫切需要開發(fā)新的治療策略或新的輔助治療方法

2、。
　　 未甲基化的CpG二核苷酸在細菌和病毒DNA中相當常見,但是在脊椎動物中卻減弱并被甲基化。包含非甲基化的CpG雙核苷酸序列在內的特定核苷酸序列具有強有力的免疫調節(jié)功能,可以作為癌癥疫苗的免疫佐劑。CpG-ODN是人工合成的含有未甲基化CpG基序的單鏈寡聚脫氧核苷酸,可以模仿細菌或病毒DNA對脊椎動物免疫系統(tǒng)產生刺激作用。根據作用特點的差別,CpG-ODN可被分成三類,其中B類CpG-ODN能刺激B細胞增生和活化,目前己作

3、為癌癥疫苗的免疫佐劑在臨床試驗中使用。B型CpG-ODN對哺乳動物免疫細胞增生活化的刺激作用主要是通過與Toll樣受體9結合,進而激活免疫系統(tǒng),誘導細胞因子的分泌和釋放,并誘發(fā)強有力的T細胞抗瘤免疫反應。
　　 最近的一些研究表明,除漿細胞樣樹突狀細胞和B細胞中有表達外,TLR9的也表達在某些腫瘤細胞,研究者證實乳腺、胃、肺和淋巴性的上皮性腫瘤中存在TLR9的表達。然而大量數據表示,TLR9的激動劑CpG寡核苷酸可促進腫瘤的發(fā)展

4、和轉移。膠質瘤屬于神經上皮性腫瘤,我們推測TLR9在膠質瘤中可能存在表達。我們的預試驗驗證了我們的想法,在細胞系和膠質瘤標本中都檢測出了其表達。我們假設,TLR9的信號通路可能在腦膠質瘤生長和進展中非常重要。TLR9信號通路在人腦膠質瘤的確切作用目前還不清楚,其對膠質瘤生長是促進還是抑制,目前還沒有相關報道。有實驗報道局部使用CpG寡核苷酸免疫治療可以延長膠質瘤小鼠的生存期。相反,Ginzkeyetal等人發(fā)現(xiàn)在大鼠腦膠質瘤模型中瘤內注

5、射免疫刺激劑CpG寡核苷酸,腫瘤大小反而增加,這與我們先前所做的實驗結果一致,在以前的實驗中我們發(fā)現(xiàn)的CpG寡核苷酸瘤內注射并不能增加GL261膠質瘤荷瘤鼠的生存時間,這結果提示,CpG直接局部注射,可能不會在膠質瘤患者產生有益的結果。
　　 已有研究者初步檢測了TLR9在膠質母細胞瘤中的表達,但沒有發(fā)現(xiàn)其對預后的意義。我們認為此研究存在一定的局限性,其研究僅進行了TLR9 mRNA水平的評價,而沒有進行蛋白質水平的研究,由于蛋

6、白質是基因功能的體現(xiàn),因此檢測TLR9蛋白在膠質瘤中表達是十分必要的,這對于提高對CpG-ODN惡性膠質瘤的免疫輔助治療的認識是至關重要的。目前還沒有系統(tǒng)的TLR9蛋白在膠質瘤中的表達情況和作用機制的研究。本研究將應用組織芯片技術,探討TLR9蛋白在大樣本的腦膠質細胞瘤樣品中的表達情況,分析TLR9的表達與臨床病理特點的關系以及TLR9表達與膠質母細胞瘤患者生存期之間的關聯(lián)。為了進一步闡述TLR9的表達對腫瘤細胞可能發(fā)揮的作用,我們還將

7、探討CpG寡核苷酸在體外對的膠質瘤細胞增殖和侵襲的直接影響。
　　 研究TLR9在神經膠質瘤中的表達和功能,及其信號傳導通路,對于理解神經膠質瘤的形成和惡性進展有重要幫助,同時也提供了膠質瘤新的有效治療靶點。
　　 方法：
　　 一、細胞和細胞培養(yǎng)
　　 惡性人腦膠質瘤細胞系U87-MG,U251-MG和大鼠腦膠質瘤C6細胞系從ATCC(美國組織培養(yǎng)細胞庫)購得,并在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室培養(yǎng)

8、。膠質瘤細胞系U87-MG、U251-MG和C6細胞以含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),于37℃,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素和5％CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
　　 二、RNA提取及RT-PCR檢測TLR9的表達
　　 采用Trizol試劑一步法提取人腦膠質瘤U87-MG、人腦膠質瘤U251-MG細胞系、大鼠腦膠質瘤C6和手術切除的人腦膠質瘤組織總RNA,紫外分光光度計檢測OD260/OD28

9、0及核酸濃度。提取細胞系和腫瘤標本的總RNA進行cDNA第一鏈合成。按照RT-PCR試劑盒的說明,應用特異性引物人類TLR9(F:5’-TGTAATAACAGTTGCCGTCCAT-3’,R:5’-CAGCCTTTCCTTGTCCTCC-3’),大鼠TLR9(F:5’-GGACAGTTCTCTCCACTCGC-3’,R:5’-TTCTTTGAGACGGGAGTGCT-3’)；人和大鼠管家基因GAPDH(F:5’-TCCACCACCCTG

10、TTGCTGTA-3’,R:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’)進行PCR擴增,產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳,并在紫外線下的觀察。
　　 三、免疫熒光檢測TLR9蛋白在細胞系中的表達
　　 U87-MG和U251細胞在蓋玻片上爬片生長,蓋玻片用無血清培養(yǎng)液沖洗后,4％多聚甲醛固定,0.5％Trixton X-100的PBS透膜,并在含5％胎牛血清的PBS中封閉1小時。細胞與TLR9的單克隆抗體在4℃孵

11、育過夜,然后由Cy3標記的抗鼠的二抗孵育2小時,細胞核用Hoechest復染。在對照樣品中,去掉一抗,膠質瘤細胞用二抗和Hocchcst染色。然后應用熒光激發(fā)Cy3和Hoechest,共聚焦顯微鏡下觀察TLR9在細胞系中的表達并拍照。
　　 四、腦膠質瘤組織芯片的構建
　　 提取腦膠質瘤組織標本,進行石蠟包埋并進行HE染色,根據世界衛(wèi)生組織2000年的分類系統(tǒng)的診斷標準重新診斷并且與病理結果比較,由神經病理學家選取代表性

12、的腫瘤區(qū)域,構建組織微陣列芯片。手術切除的正常腎臟組織作為陽性對照。
　　 五、腦膠質瘤組織芯片免疫組織化學染色
　　 4um組織芯片切片在65℃烤30分鐘,二甲苯脫蠟和水化后,切片浸入乙二胺四乙酸的緩沖液中進行高壓抗原修復,然后經過3％過氧化氫.滅活內源性過氧化物酶,1％胎牛血清封閉。抗人TLR9抗體,4℃孵育過夜。陰性對照,一抗為正常小鼠血清。人正常腎樣品作為陽性對照。根據免疫組化試劑盒說明,辣根過氧化物酶標記的二抗

13、聚合物在室溫下孵育30分鐘,DAB顯色,蘇木素復染后封片。結果在光學顯微鏡下觀察并拍照分析。
　　 六、MTT法評估CpG-ODN對腦膠質瘤細胞增殖的影響
　　 對數增長期的人腦膠質瘤U87-MG、U251-MG和大鼠膠質瘤C6細胞系接種到96孔板中。然后孵育讓細胞粘附,加入TLR9的激動劑ODN 2006,對照組加入ODN 2006 Control或相同體積的培養(yǎng)基。5mg/ml的MTT溶液過濾滅菌,不同時間點加入20

14、ul MTT。然后孵育4小時,吸凈培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜150μl,振蕩10分鐘充分溶解結晶后,選擇,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔在490nm波長處的光吸收值。
　　 七、Trallswell法測定CpG-ODN對腦膠質瘤細胞侵襲力的影響
　　 在具有直徑為8um微孔基底膜的小室內預先鋪好基質膠。1±104的U87膠質瘤細胞連同200ul的培養(yǎng)基(含1％FBS)置于上室,下室置500μl的培養(yǎng)基(含20％FBS)。上下

15、室內分別加入TLR9的激動劑ODN 2006,對照組加入ODN 2006Control或者相同體積的培養(yǎng)基,氯喹(10uM)作為TLR9的特異性阻斷劑。37℃孵育24小時后,用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞。在過濾器的下表面細胞用甲醇和冰醋酸混合物(3:1)固定30分鐘,風干后吉姆薩染色。侵入的細胞數在任意5個200高倍鏡下視野觀察計數,實驗重復3次,進行統(tǒng)計學分析。
　　 八、統(tǒng)計學分析
　　 使用Windows SPS

16、S 13.0統(tǒng)計軟件進行所有的統(tǒng)計學分析。腫瘤細胞增殖和侵襲實驗的組間比較使用t檢驗。TLR9的表達水平與膠質瘤惡性分級的關聯(lián)使用Jonckheere-Terpstra檢驗,使用卡方檢驗進行組間比較。構建Cox回歸模型,多因素分析TLR9的表達水平與膠質母細胞瘤病人無進展生存期的關系。用Kaplan-Meier方法構建生存曲線,對數秩檢驗log-rank進行組間比較。P≤0.05認為有顯著性差異。
　　 結論：
　　 我

17、們的數據顯示,TLR9在膠質瘤細胞系和腦膠質瘤組織有表達,而且TLR9在膠質瘤細胞中是有功能的。TLR9識別含有CpG基序的寡核苷酸,在與配體結合后,TLR9的信號通路可能誘導腫瘤發(fā)生炎癥或微環(huán)境的變化。CpG-ODN可顯著提高膠質瘤細胞的侵襲力,我們證實是由CpG-ODN激活的TLR9信號傳導促進了膠質瘤細胞侵襲性的增加,這是因為TLR9的抑制劑氯喹能明顯抑制CpG-ODN誘導的U87細胞侵襲能力的增強。應用膠質瘤組織芯片技術,通過對