MicroRNa-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及其對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)特性的影響和機制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是始發(fā)于顱內(nèi)的最常見惡性腫瘤，占所有惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的78％，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％。當今世界膠質(zhì)瘤的治療仍然是神經(jīng)外科領(lǐng)域最棘手的問題之一，目前，針對膠質(zhì)瘤尚無有效的篩查或早期診斷方法，確診時往往已為晚期，盡管近幾十年來以手術(shù)為主的治療手段有很大的進展，但是膠質(zhì)瘤的生長速度快、邊界不清、術(shù)后容易復(fù)發(fā)等特點都使膠質(zhì)瘤的治療效果難以令人滿意，其預(yù)后尚不樂觀，其中多形性膠質(zhì)母細胞瘤的中位生存期僅為12-15個月，因此在手術(shù)切除

2、腫瘤的同時必須尋找新的治療方法輔助治療才能使膠質(zhì)瘤的治療產(chǎn)生本質(zhì)的進步。近年來，有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療的研究已深入到了分子水平，涉及到膠質(zhì)瘤發(fā)生，發(fā)展，尤其是演變過程的基因有多種。因此尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)生相關(guān)的致病基因，從基因水平上進行針對性防治可能成為有效治療膠質(zhì)瘤的根本途徑。
　　 miRNAs是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNAs，通過與靶mRNA3'非編碼區(qū)完全或非完全互補的結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯過

3、程的抑制，進而調(diào)控基因的表達，miRNAs能參與一系列重要的生物學(xué)行為，例如細胞分化、細胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等，同時有報道m(xù)iRNAs與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，在腫瘤的發(fā)生過程中起到調(diào)控的樞紐作用，因此已經(jīng)有專家預(yù)測，把miRNA作為腫瘤生物治療的靶分子將比編碼分子作為靶分子更加有效。miRNA將成為腫瘤生物治療領(lǐng)域的一個新亮點，可能會給腫瘤的藥物設(shè)計和進行針對性治療提供一個新的平臺。
　　 已有文獻報道m(xù)iR-34參

4、與p53和Notch信號通路的調(diào)控，具有腫瘤抑制的特性。在哺乳動物中，miR-34家族包括3類:miR-34a具有自己的轉(zhuǎn)錄本，而miR-34b和miR-34c則共享一個轉(zhuǎn)錄本。有報道稱在胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和非小細胞肺癌中miR-34a低表達或檢測不到。亦有報道m(xù)iR-34a在肺癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤的細胞系中處于失活狀態(tài)。有人報道在惡性黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、口腔鱗狀細胞癌中，由于CGP島甲基化表現(xiàn)為miR-34

5、b/c的失活。并且，miR-34a的低表達和非小細胞肺癌的高復(fù)發(fā)率相關(guān)，表明miR-34a能夠作為對非小細胞肺癌判斷預(yù)后的新的靶標。到目前為止，所有已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明在惡性腫瘤中miR-34的失活是常有的事。但miR-34c作為miR-34家族中的一員，在膠質(zhì)瘤中的表達及對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起到的具體作用還未見報道。
　　 本實驗應(yīng)用定量PCR方法對18例腦膠質(zhì)瘤標本和5例腦組織標本分別進行miR-34c-3p和miR-34c-5p含

6、量的檢測，研究miR-34c-3p和miR-34c-5p在人類腦膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義。并應(yīng)用LipofectamineTM RNAiMAX對人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87進行轉(zhuǎn)染，采用多種方法對轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細胞株的轉(zhuǎn)染效率、細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、細胞周期、細胞凋亡等生物學(xué)特性進行檢測，而后應(yīng)用數(shù)據(jù)庫檢索miR-34c-3p和miR-34c-5p可能的下游靶基因，找到感興趣的共同調(diào)控的靶基因Notch2，并采用westen

7、blot實驗方法及熒光素酶報告基因技術(shù)進行直接驗證，探索miRNA-34c是否對靶基因Notch2有直接調(diào)控關(guān)系，進一步闡明作用機理，期望為膠質(zhì)瘤的基因治療找到有效可行的治療靶點并為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為腫瘤的治療提供一個新思路。本實驗共分三個部分。
　　 第一部分miRNA-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達研究
　　 目的:探討miRNA-34c在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達情況。
　　 方法:應(yīng)用定量PCR方法對18例

8、WHO分級Ⅱ-Ⅳ級的福爾馬林固定石蠟包埋的腦膠質(zhì)瘤標本和外傷或腦出血患者內(nèi)減壓手術(shù)獲得的5例腦組織標本分別進行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的檢測，比較不同級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達差異，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達和膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達皆顯著減少，而且

9、miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達隨著膠質(zhì)瘤級別或惡性程度的增加分別減少，呈顯著的負相關(guān)（miR-34c-3p的spearman相關(guān)系數(shù)=-0.856，P＜0.001; miR-34c-5p的spearman相關(guān)系數(shù)=-0.767，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:MiR-34c在人腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達顯著降低，而且表達隨著腫瘤分級或惡性程度的增高而減少，與膠質(zhì)瘤級別的升高呈顯著的負相關(guān)。MiR-34c在膠質(zhì)瘤的進展中

10、有重要的意義，可作為腦膠質(zhì)瘤臨床分級的重要指標。
　　 第二部分上調(diào)miR-34c抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲
　　 目的:研究miR-34c對人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87的增殖、遷移、侵襲、凋亡和細胞周期的影響。
　　 方法:應(yīng)用脂質(zhì)體將miR-34c導(dǎo)入膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87后，應(yīng)用定量PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，應(yīng)用MTS法檢測細胞增殖變化、Transwell小室檢測細胞遷移侵襲能力變化、流式細胞儀檢測細胞

11、凋亡和細胞周期的改變。
　　 結(jié)果:在U87和U251細胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達量要明顯小于正常膠質(zhì)細胞系HEB。而轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p的U87和U251細胞，其miR-34c-3p的表達量明顯高于未轉(zhuǎn)染組的細胞(Normal組，P＜0.05)和NC組細胞(P＜0.05)，miR-34c-5p也呈同樣的變化。在U251細胞中，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96小

12、時，細胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)和NC組(P＜0.05)。而在U87細胞中情況有所不同，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后48、72、96小時，細胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)和NC組(P＜0.05);轉(zhuǎn)染miR-34c-5p后24、48、72、96小時，細胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)，而與NC組沒有顯著差異(P＞0.05)。利用Transwell小室，U251細胞轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或

13、miR-34c-5p后，其遷移至下室的細胞數(shù)量與Normal組和NC組相比顯著減少，在U87細胞中的情況相同。U251細胞高表達miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87細胞高表達miR-34c-3p可以導(dǎo)致細胞停滯在S期，同時降低了G0/G1期的細胞數(shù)。在U251細胞中，凋亡細胞在Normal組和NC組分別占6.57％和6.3％，而轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡細胞所占比例上升分別占28.49％和28.1

14、4％。但是在U87細胞中有所不同，僅轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后凋亡細胞數(shù)上升(3.56％)，而Normal組，NC組和轉(zhuǎn)染miR-34c-5p組分別為1.53％，1.68％和1.91％。
　　 結(jié)論:轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-34c在膠質(zhì)瘤中的表達能夠抑制其增殖、遷移和侵襲能力，導(dǎo)致細胞周期在S期及G2/M期的停滯，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，為腦膠質(zhì)瘤靶向治療提供可靠的依據(jù)。但miR-34c-3p與miR34c-5p在不同細胞系中，影響細胞增

15、殖能力、細胞周期變化及誘導(dǎo)細胞凋亡的效果有所不同，推測他們可能是通過不同靶點或機制起作用。
　　 第三部分MiR-34c在膠質(zhì)瘤細胞中的靶基因及作用機制
　　 目的:探討miR-34c在膠質(zhì)瘤細胞中作用的下游靶基因及作用機制
　　 方法:通過miRanda、PICTAR、TargetScan三個數(shù)據(jù)庫篩選miR-34c的預(yù)測靶點，從中找到我們感興趣的基因，再利用定量PCR和Western技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細胞

16、該基因的表達情況，最后利用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C該感興趣基因確實為miR-34c的下游靶基因。
　　 結(jié)果:通過多種數(shù)據(jù)庫的篩選，我們最終將感興趣的基因鎖定在Notch2。定量PCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后的Notch2 mRNA的表達量相比Normal組和NC組顯著降低(P＜0.05)，但轉(zhuǎn)染miR-34c-5p后卻沒有明顯變化。Western blot的結(jié)果同樣顯示，U251和U87細胞轉(zhuǎn)染miR-34c-3

17、p后的Notch2的表達量相比Normal組和NC組降低了15％。而轉(zhuǎn)染miR-34c-5p后Notch2的表達量沒有顯著變化。在轉(zhuǎn)染克隆有Notch2基因3'UTR質(zhì)粒的實驗中，miR-34c-3p組與空白組和NC組相比，熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)，證明miR-34c-3p能與Notch2基因3'UTR結(jié)合，從而抑制熒光素酶的活性。miR-34c-3p Inhibitor組與空白組和NCInhibitor組相比，熒光素酶活性

18、顯著升高(P＜0.05)，證明miR-34c-3pInhibitor能封閉內(nèi)源miR-34c-3p，抑制miR-34c-3p的作用。在轉(zhuǎn)染克隆有mut Notch2-2基因3'UTR質(zhì)粒的實驗中，miR-34c-3p組與空白組和NC組均無差異，證明miR-34c-3p不能與mut Notch2-2基因3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的活性，突變完全。在轉(zhuǎn)染克隆有Notch2基因3'UTR質(zhì)粒的實驗中，miR-34c-5p組與空白組和NC組均

19、無差異，證明miR-34c-5p不能與Notch2基因3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的活性。同時在轉(zhuǎn)染克隆有mut Notch2-1基因3'UTR質(zhì)粒的實驗中，miR-34c-5p組與空白組和NC組均無差異，證明miR-34c-5p不能與mut Notch2-1基因3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的活性。
　　 結(jié)論:轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p的膠質(zhì)瘤細胞其Notch2表達量明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-34c-5p的沒有顯著變化。利用熒光