MicroRNA-128在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學功能研究.pdf

1、MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，可以通過結(jié)合到靶基因的3’非編碼區(qū)、5’非編碼區(qū)或者蛋白編碼區(qū)來促進或抑制靶基因的表達，其中目前研究最多的調(diào)控方式是它以不完全互補的形式結(jié)合到目的基因的3’非編碼區(qū)，來抑制靶基因的表達。MiRNA的功能涉及到各個生理和病理過程中，在人類最常見的腦腫瘤之一——神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中也可能起著舉足輕重的作用。
　　 在本研究中，我們首先選取了9例膠質(zhì)瘤樣本組織(包括II級、III級和IV級各3

2、例)，4株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(T98G、U87、U251、A172)和2例正常腦組織，用real—timePCR的方法檢測了miR—128在其中的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在膠質(zhì)瘤組織和細胞系中的表達都明顯低于正常腦組織，而且其表達和病理分級相關，病理分級越高，miR—128表達越低。
　　 將miR—128的成熟序列轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤T98G細胞后，MTT實驗和BrdU摻入實驗檢測到活細胞數(shù)減少、增殖減緩，但用hochest染色法沒有觀

3、察到有細胞凋亡的現(xiàn)象。因此，miR—128可能影響到與細胞增殖有關的某個或某些基因的表達，但可能不涉及細胞的凋亡。進一步結(jié)合生物信息學的預測，我們尋找了相關的8個與細胞增殖或者神經(jīng)分化相關的基因作為預選靶基因，包括E2F3a、BMI—1、SOX11等，將它們含有miR—128結(jié)合位點的序列克隆到熒光素酶報告基因的下游，發(fā)現(xiàn)miR—128可以與E2F3a3’UTR區(qū)的靶位點結(jié)合并抑制其所在報告基因的表達。將miR—128轉(zhuǎn)入T98G細胞，

4、Western Blot實驗檢測到miR—128可以減少內(nèi)源性E2F3a的蛋白水平，但不影響其mRNA水平。說明E2F3a可能是miR—128在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的一個靶基因。
　　 E2F3a是一個細胞從G1期到S期的調(diào)控因子，E2F3a的高表達能促進細胞的增殖，相反則抑制細胞的增殖。我們同樣選取了9例膠質(zhì)瘤樣本組織(包括II級、III級和IV級各3例)和2例正常腦組織，從Western Blot實驗和免疫組化實驗中都發(fā)現(xiàn)E2F3a

5、的表達在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中要明顯高于正常腦組織，與miR—128的表達呈負相關。合成E2F3a的siRNA序列，抑制其表達后可以引起與增加miR—128類似的效應；而在增加miR—128的同時過表達E2F3a又可以部分的挽救由miR—128引起的增殖抑制。進一步說明miR—128可能影響到神經(jīng)膠質(zhì)瘤中E2F3a的表達。同時表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR—128還調(diào)控除E2F3a外的其它基因的表達。
　　 為了進一步全景式分析miR—12

6、8在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中調(diào)控的靶基因，我們采用pSILAC蛋白質(zhì)組學技術，鑒定miR—128在膠質(zhì)瘤中調(diào)控的靶基因。質(zhì)譜結(jié)果共檢測到1700多個蛋白，其中表達增加0.5倍以上只檢測到4個，表達降低50％以上的檢測到57個，主要與細胞的代謝、增殖等有關。根據(jù)經(jīng)典的miRNA靶位點預測方式，在這57個基因中TROVE2、CCNK等7個基因的mRNA3’UTR區(qū)具有miR—128的結(jié)合位點，它們可能為miR—128的直接靶基因。而其它基因可能與miR