ADAR1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人體常見的惡性腫瘤之一,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤中擁有較高的死亡率。膠質(zhì)瘤在顱腦疾病的死亡率中,位于腦卒中之后,居第二位。目前在惡性程度最高的膠質(zhì)瘤中其中位生存期僅約為15.8個月,5年期生存率只約為9.6％。究其高死亡率的原因主要是因?yàn)槟z質(zhì)瘤細(xì)胞具有高度的異型性、較強(qiáng)的生物侵襲性及對化放療等治療不敏感的特點(diǎn)。而目前由于對膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制尚未有完全的了解,所以尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方案來治療膠質(zhì)瘤。因此深入的研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制已成為

2、治療膠質(zhì)瘤急需解決的問題。
　　而導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生的致癌作用是一個復(fù)雜的,多階段的過程,它是細(xì)胞在受外源性和內(nèi)源性的作用因子下共同發(fā)生發(fā)展所導(dǎo)致的結(jié)果。近年來,研究顯示DNA突變?yōu)樵S多癌癥的發(fā)生發(fā)展提供了重要的分子線索。特別是轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控事件,例如RNA編輯,正在成為研究包括人類腫瘤等多種疾病的新方向。ADARs酶家族能夠通過對轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的目標(biāo)RNA序列進(jìn)行將腺嘌呤脫氨基的作用,使腺嘌呤轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤,影響翻譯中堿基的配對,從而完成對

3、RNA的編輯。這種編輯的表達(dá)和活化在對正常細(xì)胞的精細(xì)調(diào)控中是必不可少的。
　　關(guān)于ADARs的RNA編輯在腫瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究還主要集中在ADAR2上。目前研究認(rèn)為,ADAR2與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲性密切相關(guān)。ADAR2可以通過作用于離子型谷氨酸受體(AMPAR亞型)mRNA的Q/R位點(diǎn),進(jìn)而改變AMPAR對Ca2+的通透性,使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度降低,從而抑制了腫瘤的增殖和侵襲性。同時相關(guān)研究在檢測ADAR2在兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

4、上的表達(dá)時,發(fā)現(xiàn)ADAR1(p110)呈高表達(dá)。認(rèn)為ADAR1(p110)可能和ADAR2形成異二聚體。從而影響ADAR2對AMPAR mRNA的編輯。但ADAR1與膠質(zhì)瘤凋亡與增殖的相關(guān)研究未見報道。而本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于檢測膠質(zhì)瘤中ADAR1的表達(dá),以及探明在對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行ADAR1干涉后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在增殖與凋亡等生物學(xué)行為上的改變,進(jìn)而探明ADAR1在膠質(zhì)瘤的發(fā)展機(jī)制中所發(fā)揮的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一檢測ADAR1在不同類

5、型成人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)
　　目的:對ADAR1在人膠質(zhì)瘤組織上的表達(dá)給予蛋白定性的檢測。
　　方法:通過Western-Blot和免疫組織化學(xué)等方法,檢測人膠質(zhì)瘤組織及其瘤旁正常組織中ADAR1的表達(dá)。
　　結(jié)果:ADAR1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于其瘤周正常腦組織。
　　結(jié)論:本次試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR1在膠質(zhì)瘤中的高表達(dá),表明其與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,以及相關(guān)生物學(xué)功能存在一定的關(guān)聯(lián),為本實(shí)驗(yàn)后期檢測干涉ADAR1后

6、的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖力與凋亡率的變化提供了理論與研究基礎(chǔ)。為進(jìn)一步探明ADAR1在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展以及對膠質(zhì)瘤的治療提供了新的理論基礎(chǔ)與研究方向。
　　實(shí)驗(yàn)二檢測ADAR1在不同人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
　　目的:通過對4種經(jīng)典人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中ADAR1表達(dá)的檢測,選擇出一種或幾種ADAR1高表達(dá)的細(xì)胞系,作為后續(xù)研究ADAR1生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)對象。
　　方法:采用Western-Blot方法對4種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中ADA

7、R1的表達(dá)進(jìn)行蛋白水平半定量檢測。
　　結(jié)果:在對4種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行ADAR1表達(dá)的檢測后發(fā)現(xiàn),T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中ADAR1的表達(dá)量最低,而U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中ADAR1的表達(dá)量較高, A172的表達(dá)量次之。
　　結(jié)論:發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)論一致,具有可靠性。因此后續(xù)試驗(yàn)將選擇U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為試驗(yàn)對象,以探明ADAR1與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)三干涉A

8、DAR1在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)
　　目的:通過ADAR1 shRNA對U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染,選擇最佳轉(zhuǎn)染效率的細(xì)胞系,并通過RT-PCR,Western-Blot等技術(shù),分別對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系進(jìn)行ADAR1的mRNA和蛋白量的檢測。最后選擇出干涉成功后的細(xì)胞系作為下一步檢測細(xì)胞增殖力與凋亡的實(shí)驗(yàn)對象。
　　方法:運(yùn)用ADAR1 shRNA對U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行順轉(zhuǎn),待轉(zhuǎn)染24h,48h,

9、72h后通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;然后根據(jù)熒光顯微鏡所觀察到的轉(zhuǎn)染效率,選取轉(zhuǎn)染效率最高的細(xì)胞系作為試驗(yàn)對象;再通過RT-PCR,Western-Blot等技術(shù),分別對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系進(jìn)行mRNA和蛋白量的檢測。
　　結(jié)果:通過倒置熒光顯微鏡分別于轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48和72h后進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h時,ADAR1-shRNA的轉(zhuǎn)染效率最高,轉(zhuǎn)染72h后綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)逐漸衰減,并發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞死亡;因此,選擇在對細(xì)胞轉(zhuǎn)染

10、48h時進(jìn)行ADAR1 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。對ADAR1-shRNA轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和Wetern-Blot檢測,結(jié)果顯示ADAR1-shRNA干擾組ADAR1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對照組和空白組。
　　結(jié)論:結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h時,ADAR1 shRNA轉(zhuǎn)染效率最高,因此后續(xù)試驗(yàn)將選擇轉(zhuǎn)染48h的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為試驗(yàn)對象,以明確ADAR1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　實(shí)驗(yàn)四檢測人

11、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在ADAR1干涉后的增殖率
　　目的:通過MTT法檢測上述兩種被順轉(zhuǎn)的經(jīng)典膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力。
　　方法:取用ADAR1 shRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,用MTT法檢測這兩種細(xì)胞系的增殖率。
　　結(jié)果:在用MTT法分別檢測經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12h、24h、48h、和72h后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR1-shRNA干擾組與陰性對照組及空白對照組相比細(xì)胞增值率明顯降低。
　　結(jié)論:通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)

12、在進(jìn)行了干涉ADAR1表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,實(shí)驗(yàn)組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖率較對照組明顯降低,因此認(rèn)為在干涉 ADAR1的表達(dá)后能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值率,而ADAR1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高增殖率有密切關(guān)系,高表達(dá)的ADAR1有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的能力。
　　實(shí)驗(yàn)五檢測人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在ADAR1干涉后的凋亡率
　　目的:通過流式細(xì)胞儀檢測上述兩種被順轉(zhuǎn)的經(jīng)典膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡水平。
　　方法:取用ADAR1 shRNA進(jìn)行

13、轉(zhuǎn)染48h的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,用流式細(xì)胞儀法檢測這兩種細(xì)胞系的凋亡率。
　　結(jié)果:在用流式細(xì)胞術(shù)法檢測經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR1-shRNA干擾組相比陰性對照組和空白對照組其細(xì)胞凋亡率明顯升高。
　　結(jié)論:通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行了ADAR1 shRNA轉(zhuǎn)染48h后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,其膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率較對照組明顯升高,因此認(rèn)為在干預(yù)ADAR1的表達(dá)后能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,而 ADAR1的高表達(dá)與膠質(zhì)