RNF138在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其體外功能研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高，治愈率低等特點。雖然各種現(xiàn)代技術(shù)迅速發(fā)展，膠質(zhì)瘤的診斷和治療取得了一定進(jìn)步，但是生存期、生活質(zhì)量等指標(biāo)仍無突破性進(jìn)展，因此探索一種新的、有效的治療方法顯得尤為重要。目前基因治療被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景的治療手段之一，而選擇合適的靶基因是基因治療的關(guān)鍵。環(huán)指蛋白RNF138為含有RING finger結(jié)構(gòu)的蛋白家族成員，該家族蛋白與鋅指蛋白家族類似，通過蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互

2、作用，參與許多生理功能的調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生。目前國內(nèi)外關(guān)于RNF138在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能研究尚少，因此本研究擬通過PCR、Western blot、免疫組化技術(shù)檢測RNF138在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及通過慢病毒（Lentivirus）介導(dǎo)的siRNA工具感染惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對其功能進(jìn)行體外研究。
　　本課題從兩個方面對RNF138進(jìn)行研究：①通過PCR、Western blot、免疫組化方法分別檢測其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及膠質(zhì)

3、瘤組織中的表達(dá)。②通過 Lentivirus介導(dǎo)的siRNA工具感染惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，體外觀察敲減RNF138基因后對U251細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響。
　　第一部分：RNF138在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)
　　目的： 檢測RNF138在五株膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44、U87、U251、A172、U373及人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討RNF138在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法： 采

4、用半定量PCR、細(xì)胞免疫熒光方法分別檢測SHG44、U87、U251、A172、U373等5株膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中RNF138 mRNA、蛋白水平的表達(dá)；實時定量PCR、Western blot、免疫組化分別檢測35例人腦膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)本（I級4例，II級13例,III級11例，IV級7例）及8例非瘤腦組織標(biāo)本中RNF138 mRNA、蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果： 半定量PCR方法從SHG44、U87、U251、A172、U373五株膠質(zhì)

5、瘤細(xì)胞株中擴(kuò)增出144bp大小的目的片段；細(xì)胞免疫熒光證實該五株細(xì)胞株中均有RNF138蛋白的表達(dá)。實時定量PCR結(jié)果提示RNF138 mRNA在人腦膠質(zhì)瘤各級別組中的表達(dá)均高于非瘤腦組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot提示各級別腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中均有RNF138蛋白表達(dá)，非瘤腦組織表達(dá)很低。免疫組化結(jié)果示各級別腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中均有RNF138蛋白表達(dá)，與非瘤腦組織表達(dá)相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且高級別膠質(zhì)瘤陽性率高于低級別膠質(zhì)瘤

6、，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論： RNF138基因高表達(dá)于人腦膠質(zhì)瘤，且與膠質(zhì)瘤惡性度相關(guān)。
　　第二部分：RNF138在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中的體外功能研究
　　目的： 體外研究下調(diào) RNF138基因?qū)盒阅z質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響，初步闡明RNF138基因在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中的生物學(xué)功能。
　　方法： 構(gòu)建Lentivirus介導(dǎo)的干擾RNF138基因的siRNA工

7、具，用其感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，設(shè)立陰性干擾對照組，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；實時熒光定量PCR檢測敲減效率；運用Cellomics儀器連續(xù)檢測RNF138基因敲減后U251體外增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測U251凋亡及細(xì)胞周期變化情況。
　　結(jié)果： 慢病毒載體高效、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，靶向RNF138的siRNA有效抑制RNF138基因表達(dá)，使RNF138 mRNA表達(dá)減少60%，U251體外增殖明顯減緩，凋亡明顯增加，細(xì)胞阻滯在