Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達及其意義的研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有播散和浸潤的特征，其惡性程度高，患者生存期短，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤相關性死亡的首要原因。雖然針對膠質(zhì)瘤的手術及輔助治療已取得了很大進展，但這未能有效地改善惡性膠質(zhì)瘤的病死率。關于膠質(zhì)瘤的起源至今還不是很明確。近年來，隨著神經(jīng)干細胞(neuralstem cell，NSC)的發(fā)現(xiàn)，以及造血系統(tǒng)腫瘤和乳腺癌中腫瘤干細胞的成功分離和證實，腫瘤發(fā)生的干細胞學說引起了腫瘤研究者的極大關注。腫瘤干細胞學說認為，

2、在腫瘤中并不是所有的而僅是一小部分腫瘤細胞，具有無限增殖和自我更新的能力來維持腫瘤的生長，這部分細胞被稱為腫瘤干細胞。目前有多個研究小組已分別成功地在多種類型膠質(zhì)瘤標本中分離出腦腫瘤干細胞(brain tumor stemcell，BTSC)。這些BTSC具有高度的自我更新和增殖能力，并且在用于分離NSC的無血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長。它們表達NSC的標志物CD133和Nestin，并且在適當?shù)臈l件下可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。雖然目前對于B

3、TSC的研究已取得了一定進展，但對于參與形成和維持BTSC的分子機制尚不清楚。 最近有學者提出，腫瘤干細胞來自于自我更新失調(diào)的正常干細胞，或是重新獲得自我更新能力的祖細胞或已分化細胞。自我更新的失調(diào)可能在腫瘤發(fā)生過程中起關鍵作用。因此，在腫瘤發(fā)生過程中，對于干細胞自我更新調(diào)節(jié)基因的研究就變得十分重要。目前已發(fā)現(xiàn)多個調(diào)節(jié)干細胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中異常激活，并在腫瘤的發(fā)生和維持中起重要作用。 Oct4(octamer

4、 transcription factor 4)，又稱為Oct3或POU5f1，屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是胚胎干(embryonic stem，ES)細胞自我更新和分化最重要的調(diào)節(jié)因子之一。Oct4只表達于具有多能性的胚胎細胞中，其中包括內(nèi)細胞群，原腸胚的外胚層細胞，原始生殖細胞(primordial germ cell)，及它們體外培養(yǎng)的對應物，如ES細胞和胚胎性生殖細胞。當這些細胞開始分化時，Oct4的表達開始下調(diào)；Oct4不

5、表達于已分化的細胞中。在小鼠中敲除Oct4基因會使內(nèi)細胞群分化為滋養(yǎng)層細胞而導致小鼠的早期死亡。這些都表明Oct4在ES細胞的自我更新和全能性維持方面起著關鍵性作用。 最近的研究表明，Oct4還具有致癌作用。Oct4是誘導已分化細胞成為干細胞樣細胞的四個關鍵性因子之一。有學者發(fā)現(xiàn)，Oct4不僅表達于具有多能性的胚胎細胞中，而且表達于成體組織的干細胞中，并且這些表達Oct4的成體干細胞是腫瘤發(fā)生中的靶細胞。Oct4在上皮組織中的持

6、續(xù)表達可阻止上皮組織祖細胞的分化而導致發(fā)育異常。Oct4的過表達可增加ES細胞來源的腫瘤的惡性程度，而抑制Oct4的表達則降低其惡性程度。最近發(fā)現(xiàn)Oct4表達于多種腫瘤組織和腫瘤細胞系中，如生殖細胞腫瘤，肝癌，乳腺癌，膀胱癌等，但是關于Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達目前尚無報道。在本研究中，我們利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，WesternBlot和免疫組織化學技術檢測Oct4基因在膠質(zhì)瘤中的表達，并且檢測Oct4的表達水平與膠質(zhì)瘤

7、惡性程度的關系。此外，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術，我們進一步分析了Oct4在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用及可能的作用機制。 第一部分Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達及與膠質(zhì)瘤惡性程度的關系 為檢測Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達，我們共收集了41例被診斷為原發(fā)性膠質(zhì)瘤的臨床標本。所有的膠質(zhì)瘤標本均經(jīng)過最后的病理診斷證實，并按照世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization，WHO)制定的

8、分級標準進行病理分級。標本中分別有14例低級別(WHOⅡ級)和27例高級別惡性程度(WHOⅢ，Ⅳ級)的膠質(zhì)瘤。作為正常對照的人腦組織標本取自于5例腦外傷病人。實驗中，我們分別提取了41例膠質(zhì)瘤標本和5例正常腦組織的總RNA和總蛋白，利用半定量RT-PCR和WesternBlot方法，分別檢測了Oct4在不同惡性程度膠質(zhì)瘤標本和正常腦組織中mRNA和蛋白的表達水平；利用免疫組織化學技術，從形態(tài)學上檢測了Oct4蛋白在不同惡性級別膠質(zhì)瘤組織

9、中的表達。RT-PCR結(jié)果顯示，Oct4mRNA在41例膠質(zhì)瘤標本中都有表達，并且Oct4的表達水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而升高。然而在5例正常腦組織標本中未檢測到明顯的Oct4的表達。WesternBlot的結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相一致。免疫組織化學結(jié)果顯示，Oct4陽性染色主要位于腫瘤細胞的胞核部位，并且惡性程度高的腫瘤標本染色強度高于惡性程度低的標本；正常腦組織中未檢測到Oct4的陽性染色。這些結(jié)果表明，胚胎性基因Oct4高表

10、達于膠質(zhì)瘤中，并且表達水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而升高。 此外，我們還利用免疫熒光法檢測了Oct4蛋白在膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251中的表達。免疫熒光結(jié)果表明，Oct4同樣高表達于U87和U251膠質(zhì)瘤細胞系中，并且Oct4陽性染色主要位于瘤細胞的胞核部位。根據(jù)Oct4的表達特點及其在干細胞全能性維持中所起的關鍵作用，我們推測在膠質(zhì)瘤標本及膠質(zhì)瘤細胞系中存在有干細胞樣(stemcelllike)瘤細胞，Oct4可能是這些干細胞

11、樣瘤細胞的標志物，并參與了這些細胞的形成及未分化狀態(tài)的維持。 第二部分Oct4對C6膠質(zhì)瘤細胞增殖及克隆形成的作用 雖然目前已發(fā)現(xiàn)Oct4表達于多種腫瘤組織及腫瘤細胞系中，但是關于Oct4在這些腫瘤中的作用卻知之甚少。為研究Oct4在膠質(zhì)瘤中的作用，我們以膠質(zhì)瘤經(jīng)典細胞系C6為體外研究模型，分別構(gòu)建了Oct4表達上調(diào)及下調(diào)的模式來研究其在膠質(zhì)瘤中的作用。 我們通過在C6細胞中轉(zhuǎn)染Oct4的表達質(zhì)粒使該基因過量表達

12、，而轉(zhuǎn)染Oct4特異性小干擾片段來抑制該基因的表達。實驗結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNAi技術都成功地在mRNA和蛋白水平上調(diào)節(jié)了Oct4的表達，上調(diào)和下調(diào)效應得到了RT-PCR和Westernblot實驗的證實。隨后，我們從細胞增殖和克隆形成兩個方面研究了Oct4在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用。結(jié)果表明，Oct4過表達的腫瘤細胞其增殖能力和克隆形成率均高于野生型瘤細胞，而抑制Oct4表達的腫瘤細胞則具有相反的結(jié)果。這說明Oct4可以促進膠質(zhì)瘤細

13、胞的增殖及自我更新。 有研究表明，腫瘤干細胞可能來自于它們相對應組織的正常干細胞。所以，在此部分實驗中，我們還通過RT-PCR，WesternBlot和免疫熒光技術檢測了C6細胞和大鼠成體NSC中Oct4的表達，并設置正常大鼠腦組織，大鼠星形膠質(zhì)細胞，和大鼠神經(jīng)元細胞為對照。RT-PCR及WesternBlot結(jié)果顯示，Oct4只表達于NSC和C6中，而在正常大鼠腦組織，大鼠星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中無表達，并且C6細胞中Oct4的

14、表達量高于NSC。免疫熒光結(jié)果顯示，Oct4的陽性染色主要位于C6細胞和NSC的胞核部位。C6細胞和NSC中Oct4表達方式的相似性表明NSC更有可能是發(fā)生惡變的靶細胞，并且Oct4的過量表達在其惡變過程中可能發(fā)揮著促進作用。 第三部分Oct4對C6膠質(zhì)瘤細胞增殖和分化作用的機制研究 我們以C6為體外膠質(zhì)瘤模型，采用與第二部分實驗相同的Oct4調(diào)節(jié)模式，對Oct4在膠質(zhì)瘤細胞增殖和分化中的作用機制進行了進一步研究。

15、 以往研究顯示，Stat3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3)在膠質(zhì)瘤及其細胞系中持續(xù)性激活，并促進瘤細胞的增殖。Stat3的激活依賴于其705位酪氨酸殘基(Tyr705)的磷酸化。為了探討Oct4在膠質(zhì)瘤中的作用是否與Stat3有關并由Stat3信號通路所介導，我們分別檢測了在Oct4表達上調(diào)及下調(diào)的模式下Stat3及其磷酸化的表達。結(jié)果顯示，Oct4

16、可以促進Stat3的磷酸化，但對Stat3蛋白總量無明顯影響。隨后，我們又檢測了Stat3對Oct4表達的影響。我們將Stat3的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到C6細胞中從而上調(diào)細胞中Stat3蛋白總量和磷酸化Stat3的表達水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Stat3表達質(zhì)粒后的C6細胞比野生型C6細胞增殖快，但細胞中Oct4mRNA及蛋白表達水平未檢測出明顯變化。這說明促進Stat3的激活是Oct4下游基因調(diào)節(jié)中的一個關鍵性事件。在膠質(zhì)瘤發(fā)生和BTSC形成過程中

17、，Oct4可能通過Stat3信號通路促進腫瘤細胞的生長增殖及自我更新。 大量研究報道，Oct4可以抑制ES細胞的分化從而維持ES細胞的全能性。所以，我們推測Oct4可能具有抑制腫瘤細胞分化的作用。神經(jīng)巢蛋白Nestin和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)是與膠質(zhì)瘤分化程度相關的標志物。 在本項研究中，我們首次報道了Oct4在膠質(zhì)瘤中高表達，并且表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度

18、成正相關，這使Oct4可能成為膠質(zhì)瘤診斷和評價治療效果的重要指標。在體外培養(yǎng)細胞中，Oct4只表達于U87、U251和C6膠質(zhì)瘤細胞系以及大鼠NSC中，而不表達于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。以C6膠質(zhì)瘤細胞為模型的研究顯示，Oct4可促進C6細胞的增殖和克隆形成。進一步的研究表明，Oct4可能通過上調(diào)Star3的磷酸化而促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖；此外，Oct4還可抑制膠質(zhì)瘤細胞的分化。這說明Oct4可能是一種腫瘤干細胞相關基因，并為腫瘤干細胞學說