Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義的研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，具有播散和浸潤(rùn)的特征，其惡性程度高，患者生存期短，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤相關(guān)性死亡的首要原因。雖然針對(duì)膠質(zhì)瘤的手術(shù)及輔助治療已取得了很大進(jìn)展，但這未能有效地改善惡性膠質(zhì)瘤的病死率。關(guān)于膠質(zhì)瘤的起源至今還不是很明確。近年來(lái)，隨著神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstem cell，NSC)的發(fā)現(xiàn)，以及造血系統(tǒng)腫瘤和乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞的成功分離和證實(shí)，腫瘤發(fā)生的干細(xì)胞學(xué)說(shuō)引起了腫瘤研究者的極大關(guān)注。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為，

2、在腫瘤中并不是所有的而僅是一小部分腫瘤細(xì)胞，具有無(wú)限增殖和自我更新的能力來(lái)維持腫瘤的生長(zhǎng)，這部分細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞。目前有多個(gè)研究小組已分別成功地在多種類型膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離出腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stemcell，BTSC)。這些BTSC具有高度的自我更新和增殖能力，并且在用于分離NSC的無(wú)血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長(zhǎng)。它們表達(dá)NSC的標(biāo)志物CD133和Nestin，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。雖然目前對(duì)于B

3、TSC的研究已取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于參與形成和維持BTSC的分子機(jī)制尚不清楚。 最近有學(xué)者提出，腫瘤干細(xì)胞來(lái)自于自我更新失調(diào)的正常干細(xì)胞，或是重新獲得自我更新能力的祖細(xì)胞或已分化細(xì)胞。自我更新的失調(diào)可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用。因此，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，對(duì)于干細(xì)胞自我更新調(diào)節(jié)基因的研究就變得十分重要。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中異常激活，并在腫瘤的發(fā)生和維持中起重要作用。 Oct4(octamer

4、 transcription factor 4)，又稱為Oct3或POU5f1，屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是胚胎干(embryonic stem，ES)細(xì)胞自我更新和分化最重要的調(diào)節(jié)因子之一。Oct4只表達(dá)于具有多能性的胚胎細(xì)胞中，其中包括內(nèi)細(xì)胞群，原腸胚的外胚層細(xì)胞，原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell)，及它們體外培養(yǎng)的對(duì)應(yīng)物，如ES細(xì)胞和胚胎性生殖細(xì)胞。當(dāng)這些細(xì)胞開(kāi)始分化時(shí)，Oct4的表達(dá)開(kāi)始下調(diào)；Oct4不

5、表達(dá)于已分化的細(xì)胞中。在小鼠中敲除Oct4基因會(huì)使內(nèi)細(xì)胞群分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞而導(dǎo)致小鼠的早期死亡。這些都表明Oct4在ES細(xì)胞的自我更新和全能性維持方面起著關(guān)鍵性作用。 最近的研究表明，Oct4還具有致癌作用。Oct4是誘導(dǎo)已分化細(xì)胞成為干細(xì)胞樣細(xì)胞的四個(gè)關(guān)鍵性因子之一。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Oct4不僅表達(dá)于具有多能性的胚胎細(xì)胞中，而且表達(dá)于成體組織的干細(xì)胞中，并且這些表達(dá)Oct4的成體干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生中的靶細(xì)胞。Oct4在上皮組織中的持

6、續(xù)表達(dá)可阻止上皮組織祖細(xì)胞的分化而導(dǎo)致發(fā)育異常。Oct4的過(guò)表達(dá)可增加ES細(xì)胞來(lái)源的腫瘤的惡性程度，而抑制Oct4的表達(dá)則降低其惡性程度。最近發(fā)現(xiàn)Oct4表達(dá)于多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中，如生殖細(xì)胞腫瘤，肝癌，乳腺癌，膀胱癌等，但是關(guān)于Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)目前尚無(wú)報(bào)道。在本研究中，我們利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，WesternBlot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Oct4基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并且檢測(cè)Oct4的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤

7、惡性程度的關(guān)系。此外，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，我們進(jìn)一步分析了Oct4在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用及可能的作用機(jī)制。 第一部分Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系 為檢測(cè)Oct4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，我們共收集了41例被診斷為原發(fā)性膠質(zhì)瘤的臨床標(biāo)本。所有的膠質(zhì)瘤標(biāo)本均經(jīng)過(guò)最后的病理診斷證實(shí)，并按照世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization，WHO)制定的

8、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)。標(biāo)本中分別有14例低級(jí)別(WHOⅡ級(jí))和27例高級(jí)別惡性程度(WHOⅢ，Ⅳ級(jí))的膠質(zhì)瘤。作為正常對(duì)照的人腦組織標(biāo)本取自于5例腦外傷病人。實(shí)驗(yàn)中，我們分別提取了41例膠質(zhì)瘤標(biāo)本和5例正常腦組織的總RNA和總蛋白，利用半定量RT-PCR和WesternBlot方法，分別檢測(cè)了Oct4在不同惡性程度膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織中mRNA和蛋白的表達(dá)水平；利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，從形態(tài)學(xué)上檢測(cè)了Oct4蛋白在不同惡性級(jí)別膠質(zhì)瘤組織

9、中的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，Oct4mRNA在41例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中都有表達(dá)，并且Oct4的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而升高。然而在5例正常腦組織標(biāo)本中未檢測(cè)到明顯的Oct4的表達(dá)。WesternBlot的結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Oct4陽(yáng)性染色主要位于腫瘤細(xì)胞的胞核部位，并且惡性程度高的腫瘤標(biāo)本染色強(qiáng)度高于惡性程度低的標(biāo)本；正常腦組織中未檢測(cè)到Oct4的陽(yáng)性染色。這些結(jié)果表明，胚胎性基因Oct4高表

10、達(dá)于膠質(zhì)瘤中，并且表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而升高。 此外，我們還利用免疫熒光法檢測(cè)了Oct4蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明，Oct4同樣高表達(dá)于U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，并且Oct4陽(yáng)性染色主要位于瘤細(xì)胞的胞核部位。根據(jù)Oct4的表達(dá)特點(diǎn)及其在干細(xì)胞全能性維持中所起的關(guān)鍵作用，我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中存在有干細(xì)胞樣(stemcelllike)瘤細(xì)胞，Oct4可能是這些干細(xì)胞

11、樣瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，并參與了這些細(xì)胞的形成及未分化狀態(tài)的維持。 第二部分Oct4對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及克隆形成的作用 雖然目前已發(fā)現(xiàn)Oct4表達(dá)于多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中，但是關(guān)于Oct4在這些腫瘤中的作用卻知之甚少。為研究Oct4在膠質(zhì)瘤中的作用，我們以膠質(zhì)瘤經(jīng)典細(xì)胞系C6為體外研究模型，分別構(gòu)建了Oct4表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的模式來(lái)研究其在膠質(zhì)瘤中的作用。 我們通過(guò)在C6細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Oct4的表達(dá)質(zhì)粒使該基因過(guò)量表達(dá)

12、，而轉(zhuǎn)染Oct4特異性小干擾片段來(lái)抑制該基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNAi技術(shù)都成功地在mRNA和蛋白水平上調(diào)節(jié)了Oct4的表達(dá)，上調(diào)和下調(diào)效應(yīng)得到了RT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。隨后，我們從細(xì)胞增殖和克隆形成兩個(gè)方面研究了Oct4在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用。結(jié)果表明，Oct4過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞其增殖能力和克隆形成率均高于野生型瘤細(xì)胞，而抑制Oct4表達(dá)的腫瘤細(xì)胞則具有相反的結(jié)果。這說(shuō)明Oct4可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)

13、胞的增殖及自我更新。 有研究表明，腫瘤干細(xì)胞可能來(lái)自于它們相對(duì)應(yīng)組織的正常干細(xì)胞。所以，在此部分實(shí)驗(yàn)中，我們還通過(guò)RT-PCR，WesternBlot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了C6細(xì)胞和大鼠成體NSC中Oct4的表達(dá)，并設(shè)置正常大鼠腦組織，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，和大鼠神經(jīng)元細(xì)胞為對(duì)照。RT-PCR及WesternBlot結(jié)果顯示，Oct4只表達(dá)于NSC和C6中，而在正常大鼠腦組織，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中無(wú)表達(dá)，并且C6細(xì)胞中Oct4的

14、表達(dá)量高于NSC。免疫熒光結(jié)果顯示，Oct4的陽(yáng)性染色主要位于C6細(xì)胞和NSC的胞核部位。C6細(xì)胞和NSC中Oct4表達(dá)方式的相似性表明NSC更有可能是發(fā)生惡變的靶細(xì)胞，并且Oct4的過(guò)量表達(dá)在其惡變過(guò)程中可能發(fā)揮著促進(jìn)作用。 第三部分Oct4對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和分化作用的機(jī)制研究 我們以C6為體外膠質(zhì)瘤模型，采用與第二部分實(shí)驗(yàn)相同的Oct4調(diào)節(jié)模式，對(duì)Oct4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和分化中的作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

15、 以往研究顯示，Stat3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)在膠質(zhì)瘤及其細(xì)胞系中持續(xù)性激活，并促進(jìn)瘤細(xì)胞的增殖。Stat3的激活依賴于其705位酪氨酸殘基(Tyr705)的磷酸化。為了探討Oct4在膠質(zhì)瘤中的作用是否與Stat3有關(guān)并由Stat3信號(hào)通路所介導(dǎo)，我們分別檢測(cè)了在Oct4表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的模式下Stat3及其磷酸化的表達(dá)。結(jié)果顯示，Oct4

16、可以促進(jìn)Stat3的磷酸化，但對(duì)Stat3蛋白總量無(wú)明顯影響。隨后，我們又檢測(cè)了Stat3對(duì)Oct4表達(dá)的影響。我們將Stat3的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到C6細(xì)胞中從而上調(diào)細(xì)胞中Stat3蛋白總量和磷酸化Stat3的表達(dá)水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Stat3表達(dá)質(zhì)粒后的C6細(xì)胞比野生型C6細(xì)胞增殖快，但細(xì)胞中Oct4mRNA及蛋白表達(dá)水平未檢測(cè)出明顯變化。這說(shuō)明促進(jìn)Stat3的激活是Oct4下游基因調(diào)節(jié)中的一個(gè)關(guān)鍵性事件。在膠質(zhì)瘤發(fā)生和BTSC形成過(guò)程中

17、，Oct4可能通過(guò)Stat3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及自我更新。 大量研究報(bào)道，Oct4可以抑制ES細(xì)胞的分化從而維持ES細(xì)胞的全能性。所以，我們推測(cè)Oct4可能具有抑制腫瘤細(xì)胞分化的作用。神經(jīng)巢蛋白Nestin和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)是與膠質(zhì)瘤分化程度相關(guān)的標(biāo)志物。 在本項(xiàng)研究中，我們首次報(bào)道了Oct4在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并且表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度

18、成正相關(guān)，這使Oct4可能成為膠質(zhì)瘤診斷和評(píng)價(jià)治療效果的重要指標(biāo)。在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，Oct4只表達(dá)于U87、U251和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及大鼠NSC中，而不表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。以C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型的研究顯示，Oct4可促進(jìn)C6細(xì)胞的增殖和克隆形成。進(jìn)一步的研究表明，Oct4可能通過(guò)上調(diào)Star3的磷酸化而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖；此外，Oct4還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分化。這說(shuō)明Oct4可能是一種腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因，并為腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)