OCT4假基因在膠質(zhì)瘤和乳腺癌扣的主其意義的研究.pdf

1、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor4，OCT4)，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)的多能性和自我更新具有十分重要的作用，并且OCT4是目前產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells)的一個(gè)必需因子。近年來，OCT4在人類腫瘤中的表達(dá)和意義也日益成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí)，OC

2、T4基因在多能性生殖細(xì)胞腫瘤中有表達(dá)，并且其表達(dá)與多能性細(xì)胞的致瘤性有關(guān)。但是，體細(xì)胞腫瘤中是否表達(dá)OCT4仍有較大爭議。許多研究報(bào)道，OCT4表達(dá)于成體干細(xì)胞和多種體細(xì)胞腫瘤中，而且腫瘤中的OCT4陽性細(xì)胞很可能就是腫瘤干細(xì)胞(cancer stemcells，CSCs)，甚至有人報(bào)道，OCT4的表達(dá)對(duì)于維持干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的存活和自我更新都是必需的。盡管如此，也有大量研究表明，OCT4在多種體細(xì)胞腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中不表達(dá)。因此，為了

3、更好的闡明腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，首先應(yīng)該確定OCT4在人類體細(xì)胞腫瘤中是否有表達(dá)。
　　 一般來說，腫瘤細(xì)胞具有無限增殖、相對(duì)未分化和侵襲性等特征，這些都與早期胚胎細(xì)胞非常相似。但是，大多數(shù)腫瘤中的細(xì)胞群體都是異質(zhì)性的，既有非常幼稚的細(xì)胞，也有幾乎完全分化的細(xì)胞。隨著干細(xì)胞理論在腫瘤研究中的應(yīng)用，腫瘤中的未分化細(xì)胞即被稱為CSCs。CSCs具有自我更新能力并且能夠分化產(chǎn)生非致瘤性腫瘤細(xì)胞，正是腫瘤中存在的一小部分CSCs促進(jìn)了腫瘤

4、的形成和生長。到目前為止，許多研究者已經(jīng)從多種腫瘤組織中成功分離培養(yǎng)出CSCs，包括膠質(zhì)瘤和乳腺癌。最近有學(xué)者提出，CSCs可能來源于自我更新失調(diào)的正常干細(xì)胞或者重新獲得自我更新能力的祖細(xì)胞或已分化細(xì)胞。不管怎樣，自我更新機(jī)制的異常激活是腫瘤發(fā)生中的一個(gè)重要事件。因此，研究腫瘤中包括OCT4在內(nèi)的參與干細(xì)胞自我更新機(jī)制的基因的表達(dá)和意義就變得十分迫切和重要。
　　 人類OCT4基因位于6號(hào)染色體，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。OC

5、T4基因通過轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接形成兩種變異體-OCT4A和OCT4B。它們翻譯形成的蛋白質(zhì)具有相同的POU和C端結(jié)構(gòu)域，而N端結(jié)構(gòu)域則不同。OCT4A定位于細(xì)胞核內(nèi)，具有維持ES細(xì)胞自我更新的功能；而OCT4B主要位于細(xì)胞漿中，并且不具有維持ES細(xì)胞自我更新的功能。通常所說的OCT4指的是OCT4A。另有研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中存在6個(gè)OCT4假基因(pseudogenes)，它們與OCT4基因有很高的序列同源性。有人報(bào)道，OCT4B表達(dá)

6、于多種體細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系中，而兩個(gè)OCT4假基因--OCT4-pg1和OCT4-pg5在多種體細(xì)胞腫瘤組織和細(xì)胞系中都有轉(zhuǎn)錄。OCT4基因剪接異構(gòu)體和假基因的存在和表達(dá)都有可能導(dǎo)致OCT4檢測(cè)的假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，檢測(cè)OCT4基因的表達(dá)時(shí)，需要將真正的OCT4與其剪接變異體和各種假基因區(qū)分開來。
　　 雖然已有報(bào)道表明，可能是OCT4剪接變異體和假基因的存在導(dǎo)致了目前腫瘤和干細(xì)胞研究中OCT4是否表達(dá)的相悖結(jié)果，但是這一問題還沒

7、有引起人們足夠的重視。在本研究中，我們利用RT-PCR和DNA測(cè)序分析的方法檢測(cè)OCT4在兩種體細(xì)胞腫瘤--膠質(zhì)瘤和乳腺癌中的表達(dá)狀況。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這兩種腫瘤中沒有檢測(cè)到真正的OCT4基因的表達(dá)，檢測(cè)出的是三種OCT4假基因--OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4。我們進(jìn)一步研究了它們的蛋白表達(dá)情況，并對(duì)這些蛋白產(chǎn)物的功能和活性進(jìn)行了探討。
　　 第一部分膠質(zhì)瘤和乳腺癌中OCT4假基因的克隆與測(cè)序分析

8、r>　　 為了檢測(cè)OCT4在人膠質(zhì)瘤和乳腺癌組織中的表達(dá)情況，我們共收集了42例膠質(zhì)瘤和45例乳腺癌的臨床標(biāo)本。所有的腫瘤標(biāo)本均經(jīng)過最后的病理診斷證實(shí)，膠質(zhì)瘤按照世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，而乳腺癌依據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá)情況進(jìn)行分型。作為正常對(duì)照的4例成人腦組織和5例乳腺組織均取自于外傷病人。在RT-PCR過程中，我們利用兩對(duì)引物來檢測(cè)OCT4 mRNA的表達(dá)

9、。OCT4A特異性引物能夠特異性擴(kuò)增OCT4A，而OCT4全長引物能夠擴(kuò)增OCT4A的全長編碼序列。當(dāng)用OCT4A特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除陽性對(duì)照精原細(xì)胞瘤外，各級(jí)別各類膠質(zhì)瘤、各類型乳腺癌、正常腦組織和乳腺組織中都沒有檢測(cè)到OCT4 mRNA(496bp)的表達(dá)；而當(dāng)用OCT4全長引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，各級(jí)別各類膠質(zhì)瘤和各類型乳腺癌中都能檢測(cè)到陽性條帶(1086bp)。此外，我們還檢測(cè)了OCT4 mRNA在多種人膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

10、情況。當(dāng)用OCT4A特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除陽性對(duì)照人多能性胚胎癌細(xì)胞系NTera-2外，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87，乳腺癌細(xì)胞系MCF7、MDA-MB-231、BT474和SK-BR-3中都沒有檢測(cè)到OCT4 mRNA(496bp)的表達(dá)；而當(dāng)用OCT4全長引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，這幾種腫瘤細(xì)胞系中都能檢測(cè)到陽性條帶(1086bp)。
　　 下一步，我們利用DNA克隆和測(cè)序分析來確定膠質(zhì)瘤和乳腺癌中是否有真正OCT4基因的表達(dá)。首

11、先，我們從瓊脂糖凝膠中回收由OCT4全長引物擴(kuò)增得到的DNA片段(1086bp)，克隆入pGEM-T easy載體中形成環(huán)狀質(zhì)粒，質(zhì)粒擴(kuò)增后進(jìn)行酶切鑒定，插入片段大小正確的克隆再進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示，OCT4基因的轉(zhuǎn)錄本只在陽性對(duì)照精原細(xì)胞瘤和NTera-2細(xì)胞中被檢測(cè)到，而在本研究收集的各種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中未檢測(cè)到真正OCT4基因的表達(dá)，檢測(cè)到的是三種OCT4假基因，即OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4，

12、它們分別位于人類染色體8q24、12p13和1q22。我們的測(cè)序結(jié)果表明，當(dāng)用OCT4全長引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，正是腫瘤組織和細(xì)胞系中存在的這些OCT4假基因的轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致了RT-PCR的陽性結(jié)果。
　　 第二部分 OCT4假基因蛋白的表達(dá)與定位研究
　　 從理論上來說，OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4的轉(zhuǎn)錄本能夠分別翻譯生成由359、186和286個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物。盡管存在著氨基酸缺失或替代，這三種O

13、CT4假基因的蛋白產(chǎn)物都有與OCT4蛋白相似的N端結(jié)構(gòu)域。
　　 為了研究OCT4假基因的蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位，我們構(gòu)建了它們的真核表達(dá)質(zhì)粒，并使它們的C端帶有HA標(biāo)簽，以便于檢測(cè)。將它們分別轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3后，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果顯示，與OCT4相似，OCT4-pg1和OCT4-pg4主要位于細(xì)胞核內(nèi)，而OCT4-pg3主要位于細(xì)胞漿中。OCT4-pg1和OCT4-pg3還能被兩種OCT4抗體--ab1

14、8976和sc-5279所識(shí)別，而OCT4-pg4不能被這兩種抗體所識(shí)別。轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和乳腺癌細(xì)胞系MCF7得到了與NIH3T3相似的結(jié)果，不同的是OCT4-pg3在這兩種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都有分布。Western blot結(jié)果顯示，OCT4-pg1、OCT4-pg3、OCT4-pg4和OCT4蛋白產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的條帶分別位于50、30、30和50 KDa。與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致，細(xì)胞核漿分離后進(jìn)行的Western bl

15、ot檢測(cè)結(jié)果顯示，OCT4-pg1、OCT4-pg4和OCT4位于NIH3T3的細(xì)胞核中，而OCT4-pg3位于細(xì)胞漿中。另外，Western blot結(jié)果顯示，OCT4-pg1和OCT4-pg3還能被OCT4抗體sc-5279所識(shí)別。兩種OCT4抗體都不能識(shí)別OCT4-pg4，可能與OCT4-pg4蛋白的N端存在較多的氨基酸缺失或替代有關(guān)。
　　 下一步，我們利用免疫化學(xué)染色檢測(cè)了OCT4假基因在腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)。當(dāng)用O

16、CT4抗體ab18976進(jìn)行免疫染色時(shí)，與NTera-2細(xì)胞中明顯的核著色不同，熒光信號(hào)在幾乎所有U251和MCF7細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都能檢測(cè)到，說明這些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)OCT4假基因。同樣，與精原細(xì)胞瘤中廣泛的核著色相比，人膠質(zhì)瘤和乳腺癌組織中只有一小部分細(xì)胞能著色，并且一些細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都有陽性著色，說明這些腫瘤組織中有OCT4假基因的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤中，能被ab18976陽性染色的細(xì)胞也能同時(shí)表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133

17、或者星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，說明膠質(zhì)瘤中OCT4假基因的表達(dá)并不局限于CSCs中。
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)檢測(cè)腫瘤組織中OCT4的表達(dá)時(shí)，OCT4假基因蛋白的表達(dá)在免疫化學(xué)染色和 Western blot中都可能產(chǎn)生假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這可能也是導(dǎo)致目前關(guān)于腫瘤和干細(xì)胞中OCT4是否表達(dá)的相悖研究結(jié)果的原因。
　　 第三部分 OCT4假基因蛋白的活性與功能研究
　　 為了研究OCT4假基因的生物學(xué)功能，我們用O

18、CT4及其假基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87和乳腺癌細(xì)胞系MCF7、MDA-MB-231。轉(zhuǎn)染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)。結(jié)果顯示，OCT4轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組，而各OCT4假基因轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比沒有明顯差別。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OCT4轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的克隆形成率明顯高于對(duì)照組，而各OCT4假基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的克隆形成率與對(duì)照組相比沒有明顯差別。OCT4假基因不能增加腫瘤細(xì)胞

19、的細(xì)胞活力，也不能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的克隆形成率，說明OCT4假基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖無明顯作用。最后，我們利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的方法檢測(cè)了這三種OCT4假基因的轉(zhuǎn)錄激活功能。OCT4能夠明顯激活三種OCT4依賴的熒光素酶報(bào)告基因載體(6×W、PORE和MORE)，而三種OCT4假基因與空載體PCDNA3相比無明顯差別，說明OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4對(duì)這三種OCT4依賴的熒光素酶報(bào)告基因載體無明顯的轉(zhuǎn)錄激活功能。<

20、br>　　 這三種OCT4假基因與真正OCT4基因的高度同源性提示它們可能具有相似的生物學(xué)功能，但本研究結(jié)果顯示，OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4不具有類似OCT4的功能。OCT4假基因在腫瘤中表達(dá)的意義以及它們?cè)谀[瘤發(fā)生中的作用有待于進(jìn)一步研究。
　　 總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，人類膠質(zhì)瘤和乳腺癌中表達(dá)三種OCT4假基因-OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4，而沒有真正OCT4基因的表達(dá)，