Oct4、SSEA-1在乳腺癌中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:Oct4,即octamer binding factor4,是POU(Pit-Oct-Unc)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,該家族能夠與某些基因順式反應(yīng)元件中的Oct序列(ATGCAAAT)結(jié)合,激活或抑制轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá),維持細(xì)胞的全能性。Oct4又被稱為POU5F1,OTF3,Oct-3/4或Oct3,其基因位于人染色體6p21.3,含有324個(gè)氨基酸,分子量18-KD。近年的研究發(fā)現(xiàn),Oct4幾乎專一表達(dá)于ES細(xì)胞中。

2、在胚胎發(fā)育的早期階段,Oct4表達(dá)于所有的卵母細(xì)胞,隨之表達(dá)于胚泡內(nèi)細(xì)胞群(ICM),而在滋養(yǎng)外胚層(TE)及原始內(nèi)胚層中的表達(dá)減少。在成體中,Oct4的表達(dá)僅限于發(fā)育中的生殖細(xì)胞。定向去除Oct4的大鼠,其胚胎缺乏多能性的ICM,這說明Oct4在維持胚胎細(xì)胞的多能性上有著重要的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高水平的Oct4表達(dá)可促使ES細(xì)胞向中胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞分化,低水平則向外胚層分化。具有正常水平Oct4的ES細(xì)胞仍可保持多能性。所以研究者認(rèn)

3、為Oct4是干細(xì)胞具有多潛能性的重要調(diào)控因子。對(duì)Oct4進(jìn)行深入研究可能將有助于揭示干細(xì)胞多潛能性的分子和細(xì)胞機(jī)制。在一些腫瘤細(xì)胞系中也存在Oct4的表達(dá),如肝癌細(xì)胞系Mahlava、宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)、胰腺癌Capan-2細(xì)胞系和Pan-1細(xì)胞系、弱致瘤性和高致瘤性人乳腺上皮干細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系-7(MCF-7)等。在表型上,人類植入前胚胎細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有相似性,尤其在不定向生長(zhǎng)分化能力方面。兩種細(xì)胞都需要經(jīng)歷重調(diào)而達(dá)到增殖

4、狀態(tài),從而具有永生、自我更新和侵襲能力。這些相似性說明在腫瘤細(xì)胞中可能有一些胚胎基因的重新表達(dá)或激活。Oct4基因可能是一個(gè)特異的分化全能性基因標(biāo)記,或者是分化全能性的必需基因,與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系,表達(dá)Oct4的細(xì)胞可能是引起腫瘤發(fā)生過程的靶細(xì)胞。對(duì)Oct4加以認(rèn)識(shí)可能發(fā)現(xiàn)一些新的惡性腫瘤的治療方法。SSEA-1(stage specific embryonic antigen-1)階段特異性胚胎抗原-1,又被稱為L(zhǎng)ewis x(L

5、ex,CD15),是一個(gè)具有Galβ(1-4)(半乳糖)Fucα(1-3)(巖藻糖)GlcNAcβ(1-3)(乙酰氨基半乳糖)結(jié)構(gòu)的三糖。在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的8細(xì)胞后期開始出現(xiàn)SSEA-1的表達(dá),在桑椹胚中表達(dá)的量最高,隨后表達(dá)于ICM及內(nèi)胚層,著床后的滋養(yǎng)外胚層不再有SSEA-1的表達(dá),而原始生殖細(xì)胞表面又再次出現(xiàn)SSEA-1。在成年小鼠的腎小管、精子、輸卵管、子宮內(nèi)膜、神經(jīng)干細(xì)胞和小腦均有SSEA-1分布;在成年人體的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)

6、膠質(zhì)細(xì)胞、外周血白細(xì)胞和紅細(xì)胞表面、胃上皮細(xì)胞均能檢測(cè)到SSEA-1;在多種腫瘤如乳腺癌,結(jié)腸癌,霍奇金淋巴瘤和急性早幼粒細(xì)胞白血病中也能檢測(cè)到SSEA-1。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的SSEA-1和唾液酸化的SSEA-1已被作為腫瘤患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。已有的研究認(rèn)為SSEA-1與受精、胚胎發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育過程中的細(xì)胞識(shí)別有關(guān):SSEA-1介導(dǎo)動(dòng)物胚胎桑椹胚時(shí)期細(xì)胞的識(shí)別與黏附;介導(dǎo)胚泡與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的識(shí)別,完成胚泡著床過程;還介導(dǎo)了動(dòng)物上皮

7、細(xì)胞間的識(shí)別、黏附與致密性組織結(jié)構(gòu)的形成。另有研究證實(shí)人類精子表面的SSEA-1在精卵結(jié)合過程中發(fā)揮了一定的作用。Maria Teresa Elola等有一項(xiàng)關(guān)于MCF-7和人多形核中性粒細(xì)胞(PMN)與人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)粘附的研究,其結(jié)果證實(shí)MCF-7癌細(xì)胞和PMN能夠與HUVEC結(jié)合,且其結(jié)合過程與SSEA-1有關(guān),他們的證據(jù)是這種粘附能夠被抗SSEA-1單抗MCS-1阻滯。該結(jié)果顯示SSEA-1是腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮相互

8、作用過程中一個(gè)必不可少的因子,這樣就給我們提供了一個(gè)通過相應(yīng)單抗進(jìn)行抑制的靶位,也意味著防止腫瘤細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移成為可能。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升。在歐美國家,乳腺癌占女性惡性腫瘤的25％~30％。20世紀(jì)末的統(tǒng)計(jì)資料表明全世界每年約有130萬人被診斷為乳腺癌,而有40萬人死于該病。在我國,乳腺癌在城市中的發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第二位,一些大城市中已經(jīng)上升至第一位,農(nóng)村中為第五位。乳腺癌已經(jīng)成為婦女健康的最大威

9、脅。自20世紀(jì)90年代以來,隨著早期診斷和綜合治療的進(jìn)步,特別是術(shù)后輔助治療的進(jìn)步,北美和英國等國家的乳腺癌死亡率有所下降。但由于腫瘤病因、發(fā)生發(fā)展以及生物學(xué)行為的復(fù)雜和不均一性,臨床腫瘤的異質(zhì)性等因素,惡性腫瘤的治療效果對(duì)每個(gè)患者來說并不十分確切,乳腺癌也不例外,因此,在遵循綜合治療、個(gè)體化等原則的基礎(chǔ)上,尋找與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的因素,探尋乳腺癌治療的新靶點(diǎn),新方法,是十分必要的。Oct4和SSEA-1在乳腺癌中的研究都處于初

10、步階段,在乳腺癌組織中是否存在確切表達(dá)?其有何意義?目前還都是空白。即使在細(xì)胞系中的研究也僅有個(gè)別報(bào)道。鑒于此,本課題研究目的包括：
　　1.探討乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中是否存在Oct4和SSEA-1的表達(dá);
　　2.觀察Oct4和SSEA-1在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中的表達(dá)情況及其意義。
　　材料與方法:1.材料:組織標(biāo)本與細(xì)胞系組織標(biāo)本:取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院05~07年手術(shù)切除組織,包括93例乳腺浸潤性導(dǎo)管

11、癌組織(患者均為首次發(fā)病,女性,術(shù)前未接受化療和放療);32例乳腺良性病變組織;2例精原細(xì)胞瘤組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理專家證實(shí)。細(xì)胞系:人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-468均由河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。細(xì)胞分別復(fù)蘇后置于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中,于飽和濕度、37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使其貼壁生長(zhǎng)。0.25％胰酶消化傳代,實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。
　　2.組

12、織標(biāo)本切片后采用免疫組織化學(xué)PV兩步法檢測(cè)Oct4的表達(dá)情況,SP法檢測(cè)SSEA-1的表達(dá)情況。
　　3.選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化離心,采用血漿和凝血酶包裹成細(xì)胞團(tuán)塊,常規(guī)固定、包埋、切片,檢測(cè)方法同組織切片。
　　4.評(píng)分方法:綜合考慮切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo),半定量判斷結(jié)果。根據(jù)陽性細(xì)胞在所觀察細(xì)胞中所占比例分為:陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為1分;11％~50％為2分;51％~75％為3分;

13、>75％為4分。根據(jù)顯色程度判斷陽性強(qiáng)度:標(biāo)本無著色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分:棕褐色為3分。兩者分?jǐn)?shù)乘積0~2分為(-);3~4分為(+);6~8分為(++);8分以上為(+++)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0處理,統(tǒng)計(jì)方法采用X2檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí),認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:1.組織切片
　　1.1、Oct4在乳腺癌中的表達(dá)率為45.2％(42/93),在乳腺良性病變

14、中的表達(dá)率為3.1％(1/32)。與乳腺良性病變相比,乳腺癌中Oct4的表達(dá)率明顯增高(P<0.05)。Oct4在乳腺癌各分子亞型中的表達(dá)率為:Luminal A型34.5％,LuminalB型33.3％,HER2過表達(dá)型66.7％,Basal-like型88.2％。乳腺癌不同分子亞型中Oct4的表達(dá)率不同,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2、SSEA-1在乳腺癌及乳腺良性病變中的陽性率均<5％。
　　2.細(xì)胞切片
　

15、　2.1、Oct4在兩種細(xì)胞系中的陽性率均<1％。
　　2.2、SSEA-1在兩種細(xì)胞系中的陽性率均>90％。
　　結(jié)論:1.乳腺癌中存在Oct4的表達(dá);乳腺癌中Oct4的表達(dá)率明顯高于乳腺良性病變;乳腺癌中Oct4的表達(dá)率與分子亞型相關(guān),其中Basal-like型表達(dá)率最高。
　　2.乳腺癌及良性病變中SSEA-1表達(dá)率低,其臨床病理相關(guān)性尚不明確。
　　3.Oct4和SSEA-1在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中的