ADAR1在消化道腫瘤中的表達(dá)及初步機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　惡性腫瘤一直以來是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，其中胃癌是世界第四大常見惡性腫瘤，其病死率高居第二位。肝癌預(yù)后非常差，每年約有63萬新發(fā)病例，并造成約59萬患者死亡，在所有惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中排第三位。在我國消化道腫瘤一直居于各種惡性腫瘤的首位，近年來盡管隨著診療技術(shù)的不斷進(jìn)步，消化道腫瘤如胃癌、肝癌及結(jié)腸癌的診斷和治療有了長足進(jìn)步，但是多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時，已經(jīng)到了中晚期，預(yù)后往往不佳。因此，深入探討一些消化道惡性腫瘤的

2、發(fā)病機(jī)制，對于早期腫瘤的篩查和診斷，及時選擇合適的治療方案，以充分提高癌癥患者生存率都起著決定性的作用。RNA編輯的定義是：DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后，除了RNA剪切外的其他加工過程，它通過刪除、添加以及修飾核苷酸等方式改變遺傳信息。RNA編輯是國際上近年來一個活躍的前沿研究領(lǐng)域，對RNA起編輯作用的酶稱為RNA編輯酶。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的RNA編輯酶包括ADAR1、ADAR2和ADAR3，其中研究最多的是ADAR1。越來越多的研究認(rèn)為RNA編輯與腫瘤

3、、炎癥的關(guān)系密切，可能部分參與了疾病發(fā)生機(jī)制。ADAR1在胃癌、結(jié)腸癌和肝癌等消化道惡性腫瘤及消化系統(tǒng)常見病如慢性肝炎、肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用國內(nèi)外鮮有報(bào)道，尤其系統(tǒng)的研究與消化道腫瘤的關(guān)系方面還未見有報(bào)道。為了進(jìn)一步研究ADAR1在胃癌、肝癌及結(jié)腸癌等惡性消化道腫瘤中的作用及內(nèi)在機(jī)制，我們設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)。
　　目的：
　　1.制備和純化ADAR1多克隆抗體，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。
　　2.探討RNA編輯酶ADAR1在胃癌

4、、肝癌、結(jié)腸癌及相應(yīng)癌旁、正常組織中的表達(dá)及定位情況，分析ADAR1與上述腫瘤臨床病理特征的關(guān)系。
　　3.了解RNA編輯酶ADAR1在HBV+、HBV-慢性肝炎、肝硬化組織中的表達(dá)情況及定位。
　　4.構(gòu)建和鑒定ADAR1過表達(dá)慢病毒載體并包裝、純化慢病毒顆粒。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系，為后續(xù)功能學(xué)的研究提供有力工具。
　　方法：
　　1.制備ADAR1抗原肽，免疫正常兔并收集、層析純化抗體。
　　2.應(yīng)用免疫

5、組織化學(xué)二步改良法（SP法）檢測胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和相應(yīng)癌旁或正常組織以及在HBV+、HBV-慢性肝炎、肝硬化組織中的表達(dá)情況。
　　3.分析以上腫瘤組織中ADAR1的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性。
　　4.設(shè)計(jì)并構(gòu)建ADAR1的慢病毒過表達(dá)載體，用293T細(xì)胞系包裝慢病毒顆粒，感染胃癌細(xì)胞系SGC-7901、MKN28，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。PCR和Western-Blot鑒定載體的有效性。
　　結(jié)果：
　　1.制

6、備出高效價的多克隆抗體anti-ADAR1(N-端)和anti-ADAR1(C-端)。
　　經(jīng)ELISA檢測抗體效價，兔血清（識別N端多肽）的抗體效價超過1:2000，效價很高。兔血清（識別C端多肽）的抗體效價超過1:64000，效價極高。這兩個抗體針對不同的抗原表位（分別位于ARDR1的N端和C端），都具有很好的效價。
　　2.胃癌和正常胃粘膜組織中ADAR1的定位與表達(dá)
　　免疫組化檢測ADAR1在246例胃癌組織

7、中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ADAR1主要定位于胃癌組織的胞漿，部分低分化彌漫型胃癌、未分化胃癌有胞核表達(dá)。ADAR1蛋白在胃癌與正常胃粘膜組織中陽性表達(dá)率分別為96.7％(238/246)和100％(134/134)，其中分別有48.3％(119/246)和89.6％(120/134)表達(dá)呈強(qiáng)陽性。比較ADAR1在胃癌和正常胃粘膜組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步分析ADAR1與胃癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)其表

8、達(dá)陽性率與組織分化、TNM病理分期有關(guān)（P<0.05）。分化程度上以高分化組陽性率為最高，明顯高于中、低及未分化組（P<0.001），且表達(dá)強(qiáng)度隨組織分化的降低而降低。TNM分期中I、Ⅱ期陽性表達(dá)率為100％（129/129)，III、IV期的陽性表達(dá)率為93.2％（109/117)，I、Ⅱ期陽性表達(dá)率明顯高于III、IV期，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。另外檢測ADAR1在40例胃癌組織中的表達(dá)陽性率為95％（38/40）

9、，在與其對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中陽性率為92.5％（37/40），經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，ADAR1在胃癌與其對應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3.在肝癌、癌旁組織，慢性肝炎以及肝硬化組織中ADAR1的定位和表達(dá)
　　在98例肝癌及其相匹配的癌旁組織中，ADAR1均分布于肝癌組織的胞漿。其蛋白表達(dá)率分別為87.8％(86/98)和98％(96/98)，陽性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。另檢測140例肝癌組織

10、，結(jié)果表明ADAR1蛋白表達(dá)陽性率與組織分化、TNM病理分期有關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡無關(guān)（P>0.05）。ADAR1的表達(dá)強(qiáng)度隨組織分化的降低而降低（P<0.01），TNM分期中以I、Ⅱ期陽性表達(dá)率為高，與III、IV期比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該蛋白在慢性肝炎、肝硬化組織中的表達(dá)定位于細(xì)胞漿，其中29例HBV+慢性肝炎及35例HBV-肝炎中表達(dá)率分別為93.1％(27/29)和97.1％(34/35)，陽性率無統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)差異(P>0.05)。在59例HBV+肝硬化及33例HBV-肝硬化中表達(dá)率分別為86.4％(51/59)和75.8％(25/33)，陽性率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。按是否考慮HBV陽性、陰性因素，比較肝炎、肝硬化兩者之間表達(dá)情況也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.ADAR1在結(jié)腸癌及其配對癌旁組織中的定位與表達(dá)
　　ADAR1蛋白在100例結(jié)腸癌及其相匹配的癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果表明，ADAR1主要定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)腸癌及其相匹

12、配的癌旁組織陽性表達(dá)率分別為88％(88/100)和98％(98/100)，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。在結(jié)腸癌組織中ADAR1蛋白表達(dá)陽性率與性別、年齡、TNM病理分期無關(guān)（P>0.05），而與組織分化有關(guān)（P<0.05），其表達(dá)強(qiáng)度隨組織分化的降低而降低。
　　5.建立了ADAR1慢病毒表達(dá)系統(tǒng)
　　我們分別構(gòu)建并鑒定了ADAR1的過表達(dá)載體pGC-LV/ADAR1P110、pGC-LV/ADAR1P150，包裝

13、病毒顆粒使用293T細(xì)胞系，并瞬時感染293T細(xì)胞，采用Q-PCR進(jìn)行病毒滴度測定及mRNA水平的初步驗(yàn)證。在證實(shí)以上表達(dá)系統(tǒng)成功建立的基礎(chǔ)上，利用該系統(tǒng)進(jìn)一步建立穩(wěn)定表達(dá)ADAR1-P110和ADAR1-P150兩個亞型和空載體對照的SGC-7901、MKN28胃癌細(xì)胞株。
　　結(jié)論：
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功制備出效價高，敏感性強(qiáng)的ADAR1抗體，并首次將其用于消化道腫瘤的表達(dá)研究，本實(shí)驗(yàn)所檢測病例均使用組織芯片，數(shù)量充

14、足，保證了試驗(yàn)在同等條件下進(jìn)行，結(jié)果相對可靠。我們的研究表明，ADAR1在消化道惡性腫瘤胃癌、肝癌、結(jié)腸癌中的表達(dá)陽性率低于相對應(yīng)的正常組織及癌旁組織，且腫瘤的表達(dá)與年齡、性別無關(guān)，而與TNM分期和組織學(xué)類型密切相關(guān)。這一研究結(jié)果提示我們ADAR1在胃癌、肝癌、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，RNA編輯酶ADAR1可能參與了胃癌、肝癌、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。進(jìn)一步研究以上三個腫瘤RNA的異常編輯以及與癌基因和抑癌基因表達(dá)的相互