核孤兒受體TR3在消化道腫瘤血管生成中的分子機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行闡述：
　　第一部分 VEGF-A以及組胺對TR3/Nur77表達的誘導作用
　　研究目的：
　　1、明確TR3三種轉錄變異體在不同細胞系中的存在及其結構差別;
　　2、檢測VEGF-A和組胺對TR3三種轉錄變異體表達的影響;
　　3、檢測其他炎性因子如TNF-a，PMA，LPS和CHX和生長因子如EGF對TR3各個轉錄變異體表達的影響。
　　研究方法：
　　1、在Gen

2、ebank數(shù)據(jù)庫進行檢索查找TR3基因編碼的3種轉錄變異體信息，比對其內含子外顯子區(qū)別，并設計特異性的實時定量PCR引物序列;用實時定量PCR和免疫印跡技術確認TR3三種轉錄變異體的存在和差異性的表達;
　　2、實驗根據(jù)情況采用非對稱t檢驗，和Mann-Whitney檢驗來進行統(tǒng)計學顯著性的檢查。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、TR3三種轉錄變異體的Genebank數(shù)據(jù)庫信息及結構和實時定量PCR

3、引物序列
　　TR3基因位于第12對染色體上，Genebank數(shù)據(jù)庫收錄的mRNA轉錄變異體有3個，分別為TR3轉錄變異體1、TR3轉錄變異體2和TR3轉錄變異體3。TR3-TV1由外顯子3-10構成，缺失外顯子1和外顯子2，TR3-TV2則由外顯子3和外顯子5-10構成，缺失外顯子1，2和4;而TR3-TV3則由外顯子1，2以及外顯子5-10構成，缺失外顯子3和4。TR3-TV1和TR3-TV2均編碼相同的59.8KDa大小的T

4、R3-異構體1蛋白;而TR3-TV3的產物為61.2KDa大小的TR3-異構體2蛋白，該蛋白比TR3-異構體1蛋白多了13個氨基酸。
　　2、TR3三種轉錄變異體在不同細胞系中的存在和差異性的表達
　　這三種TR3轉錄變異體在細胞內的表達水平不同，在HUVEC和HDMVEC中都是TR3-TV1表達最低，而TR3-TV3的表達最高。我們進一步對VEGF-A刺激下三種TR3轉錄變異體的表達情況進行了研究。數(shù)據(jù)顯示，在內皮細胞中存

5、在TR3轉錄變異體，且這些TR3轉錄變異體在VEGF-A/Histamine的刺激下表達上調程度有所差異。
　　3、其他炎性因子如TNF-a，PMA，LPS和CHX和生長因子如EGF對TR3各個轉錄變異體表達的影響
　　對HUVEC細胞，人結腸腫瘤細胞HCT116、人前列腺癌腫瘤細胞PC3和LnCap用生長因子EGF或炎性因子TNF-a，PMA，LPS和CHX進行刺激，發(fā)現(xiàn)，TR3的這三種轉錄變異體廣泛存在于這些細胞內，并且

6、在受到不同的炎性因子和生長因子刺激時，表達可以有不同程度的上調。
　　結論：
　　1、TR3存在三種轉錄變異體，且這三種轉錄變異體的表達存在差異性;
　　2、VEGF-A和組胺對TR3轉錄變異體的表達有很強的刺激作用，且均以TR3-TV2表達上調最為明顯;
　　3、TR3三種轉錄變異體也存在于其他腫瘤細胞系中，且不同的炎性因子和生長因子對其表達的影響不同。
　　第二部分 VEGF-A和組胺對TR3/Nur7

7、7表達誘導作用的分子機制
　　研究目的：
　　1、檢測參與介導VEGF-A和組胺對TR3轉錄變異體轉錄影響的可能信號通路。
　　2、檢測VEGF家族不同成員對TR3轉錄變異體轉錄的影響，并確定參與VEGF-A誘導TR3轉錄上調的VEGF受體類型。
　　3、檢測IGF-1R在VEGF-A誘導的TR3轉錄上調過程中的作用。
　　4、檢測介導組胺誘導的TR3轉錄上調的受體類型以及IGF-1R對組胺誘導的TR3轉錄

8、上調的影響。
　　研究方法：
　　1、實時定量PCR方法檢測多條常見信號通路抑制劑和shRNA對VEGF-A和組胺誘導TR3轉錄變異體轉錄的影響。
　　2、實時定量PCR方法檢測VEGF家族不同成員對TR3轉錄變異體轉錄的影響，并用免疫印跡方法檢測VEGF下游MAPK表達情況。
　　3、用VEGF和EGF受體嵌合體系統(tǒng)對參與VEGF誘導TR3轉錄上調的VEGF受體類型繼續(xù)確認，并檢測其下游MAPK的表達。

9、　　4、加入IGF-1R特異性抑制劑和shRNA后，觀察IGF-1R在VEGF-A誘導的TR3轉錄上調過程中的作用。用免疫印跡方法檢測VEGF對IGF-1R磷酸化的影響，并用免疫共沉淀方法檢測KDR與IGF-1R的相互作用。用特異性組胺受體抑制劑研究介導組胺誘導TR3轉錄避變異體的受體類型，并探討IGF-1R對該通路的影響。
　　結果：
　　1、參與調節(jié)VEGF-A誘導TR3轉錄變異體表達的信號通路
　　發(fā)現(xiàn):BAPT

10、A/AM和環(huán)孢菌素-A幾乎能完全阻斷VEGF-A對TR3-TV2和TR3-TV3表達的誘導作用。而且，PLC抑制劑U-73122，PLC顯性失活對照，PKC抑制劑GF109203X，經PMA處理的PKC表達下調，PKCδ顯性失活突變體，PKD抑制劑，PKD異構體1shRNA，和MEK抑制劑(PD98059)，IκB shRNA，p38抑制劑SB203580以及JNK抑制劑Ⅱ都幾乎能完全抑制VEGF-A誘導的TR3-TV2和TR3-TV3

11、表達上調。這些數(shù)據(jù)表明，Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路，NF-κB通路以及MAP激酶通路在VEGF-A誘導的TR3-TV2和TR3-TV3表達發(fā)揮關鍵性作用，而PI3K-Akt通路則沒有參與該過程的調節(jié)用。
　　2、參與調節(jié)組胺誘導TR3轉錄變異體表達的信號通路
　　對組胺誘導TR3轉錄變異體表達調節(jié)的信號通路研究發(fā)現(xiàn):Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路，以及MAP激酶（ERK）通路在組胺誘導的TR3-TV2和T

12、R3-TV3表達發(fā)揮關鍵性作用，而PI3K-Akt通路和NF-κB通路則沒有參與該過程的調節(jié)用。
　　3、VEGF家族其他成員對TR3-TV2和TR3-TV3表達的誘導作用
　　VEGF-A與VEGFR1/Flt-1，VEGFR2/KDR，神經氈蛋白1(NP-1)以及神經氈蛋白2（NP-2）都能結合，VEGF-B和P1GF僅能與VEGFR1/Flt-1，NP-1和NP-2發(fā)生相互作用，而VEGF-E則僅能夠與VEGFR2/K

13、DR發(fā)生相互作用。數(shù)據(jù)表明，VEGFR2/KDR，而非VEGFR1/Flt-1或者神經氈蛋白介導了VEGF誘導的TR3-TV2和TR3-TV3表達。
　　4、VEGF嵌合受體無法導致TR3-TV2的高表達
　　所得的數(shù)據(jù)顯示:與對照組相比相比，經轉染EGDR的HUVEC細胞中，EGF僅能誘導TR3-TV2mRNA表達上調15倍作用，比VEGF-A或者VEGF-E誘導的非轉染細胞低75％，而EGF誘導的TR3-TV3為5倍左右

14、，與VEGF-A或者VEGF-E誘導的非轉染HUVEC細胞類似。同時，研究表明除了VEGFR2/KDR外，應該還有其他受體參與了VEGF-A誘導的TR3-TV2高表達。
　　5、IGF-1R對VEGF-A刺激下的TR3-TV2表達的影響
　　對HUVEC細胞予以VEGFR2/KDR激酶抑制劑SU1498，IGF-1R激酶抑制劑AG1024處理后，或者進行轉染shKDR或者shIGF-1R2后，予以VEGF-A刺激，實時定量P

15、CR數(shù)據(jù)顯示，AG1024和shIGF-1R2能顯著性抑制TR3-TV2的表達上調，而shKDR幾乎能同時完全抑制VEGF-A所誘導的TR3-TV2和TR3-TV3兩種變異體的表達。綜合所有這些數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)VEGFR2/KDR介導了VEGF-A所誘導的TR3-TV3表達，而VEGFR2/KDR或者EGDR僅能介導VEGF-A所誘導的低水平的TR3-TV2表達，高水平的TR3-TV2表達則需要另一種受體-IGF-1R的共同參與。
　　

16、6、VEGF-A所誘導的IGF-1R磷酸化以及其與VEGFR2/KDR的交聯(lián)作用
　　進一步對IGF-1R調節(jié)VEGF-A誘導TR3變異體表達的信號通路進行了研究。數(shù)據(jù)表明， VEGF-A能夠誘導VEGFR2/KDR和IGF-1Rα/IGF-1Rβ的物理學相互作用。
　　7、參與組胺誘導的TR3轉錄變異體表達的受體類型及IGF-1R對該過程的影響
　　對經血清饑餓處理的HUVEC細胞分別用H1，H2和H4特異性的阻斷劑

17、處理后，發(fā)現(xiàn)TR3-TV2的轉錄刺激主要由H1受體介導，而TR3-TV3的轉錄上調則由H1和H4共同介導。結果表明，組胺通過其受體H1和H4介導對TR3轉錄的誘導，并且受體IGF1-R似乎也對這一通路有一定影響，但具體機制尚不明確。
　　結論：
　　1、鈣PLC-PKC-PKD1通路和NF-κB通路和MAP激酶（ERK，p38和JNK）通路在VEGF-A誘導的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表達中都起到重要作用;而組胺

18、誘導的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表達則主要由鈣PLC-PKC-PKD1通路介導。
　　2、VEGFR2/KDR，而非VEGFR1/Flt-1或者神經氈蛋白介導了VEGF誘導的TR3-TV2和TR3-TV3表達。
　　3、VEGF-A和VEGF-E可以誘導胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)的磷酸化，并促成其與VEGF受體2(KDR)發(fā)生交聯(lián)，進而導致TR3-TV2的高表達。
　　4、組胺通過其受體H1和