消化道惡性腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能的初步研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤一直以來是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，在世界范圍內(nèi)，消化道惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均較高。為了闡明惡性腫瘤的形成機(jī)制，更好地防治惡性腫瘤，一百多年來人們提出了多個(gè)惡性腫瘤形成假說，其中“免疫監(jiān)視假說”被廣泛接受，尤其是近年來基于該假說的免疫（細(xì)胞）治療技術(shù)在惡性腫瘤的治療領(lǐng)域取得舉世矚目的突破和進(jìn)展?；谠摷僬f，免疫系統(tǒng)具有識(shí)別、殺傷并及時(shí)清除體內(nèi)突變細(xì)胞，防止腫瘤發(fā)生的功能。當(dāng)機(jī)體免疫功能降低時(shí)，腫瘤的發(fā)生率明顯升高，同

2、時(shí)腫瘤進(jìn)行性浸潤(rùn)生長(zhǎng)進(jìn)一步抑制患者的免疫功能。已有研究發(fā)現(xiàn)：惡性腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能普遍低下，腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和NK細(xì)胞的活性均顯著下降；小鼠RAG-2基因的敲除對(duì)宿主腫瘤影響佐證了免疫監(jiān)視系統(tǒng)的存在。由于免疫細(xì)胞的功能直接或間接依賴于細(xì)胞內(nèi)ATP的能量供應(yīng)，而線粒體是細(xì)胞的能量工廠，主要通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供動(dòng)力?；诖?，我們提出了“外周血免疫細(xì)胞線粒體功能降低與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)”的假說。
　　目的：本課題

3、通過對(duì)消化道惡性腫瘤患者與健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能的病例對(duì)照研究，探討外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能改變與消化道惡性腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系，以驗(yàn)證我們提出的假說，并為今后深入研究惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及診斷和治療等提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象：消化道惡性腫瘤患者來自天津腫瘤醫(yī)院，所有入選病例組的患者均為首次確診為消化道腫瘤（胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌），所有入組研究對(duì)象均未進(jìn)行過手術(shù)切除、放化療。正常對(duì)照組來自在同

4、一時(shí)期中國(guó)人民解放軍第272醫(yī)院門診健康體檢人員，沒有腫瘤史。對(duì)照組與病例組研究對(duì)象的年齡、性別構(gòu)成無明顯差別。所有研究對(duì)象均為漢族。
　　2.外周血單個(gè)核細(xì)胞分離：采集肘靜脈血，EDTA-K2抗凝，于室溫1600×g離心10min，上層血漿分裝后于-80℃保存待用。采用Ficoll密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，主要包括T、B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞和單核細(xì)胞。
　　3.機(jī)體氧化/抗氧化水平的檢測(cè)：利用DCFH

5、-DA探針測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞ROS含量。Mito SOX線粒體紅色熒光探針測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS，分光光度計(jì)檢測(cè)血漿總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力和丙二醛（MDA）的含量。
　　4.外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)：提取腫瘤患者與健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞總DNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time Quantitative Polymerase Chain React

6、ion，real-time qPCR）測(cè)定入選病例組及對(duì)照組研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)。
　　5.外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能的檢測(cè)：外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)羅丹明123（Rhodamine123）染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別測(cè)定CD3+CD19-T細(xì)胞、CD3-CD19+B細(xì)胞、CD3-CD56+NK細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞線粒體膜電位；裂解外周血單個(gè)核細(xì)胞后，螢火蟲熒光素酶法測(cè)定三磷酸腺苷(adenosine triph

7、osphate，ATP)含量，結(jié)果以nmol/mg蛋白表示。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)檢測(cè)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示。對(duì)于定性數(shù)據(jù)，比較各組的分布差別時(shí)用卡方檢驗(yàn)；對(duì)于定量數(shù)據(jù)，比較各組的差別時(shí)用單因素方差分析，用SNK法進(jìn)行兩兩比較。各檢驗(yàn)方法的顯著性水平為雙側(cè)P＜0.05。
　　結(jié)果：
　　1.研究對(duì)象一般資料的分布特征：
　　消化道腫瘤病例組與正

8、常對(duì)照組在性別（P=1.00）、年齡（56.68±8.42 vs57.20±6.81歲，P=0.68）、長(zhǎng)期居住地(天津)、吸煙（P=0.89）、飲酒（P=0.79）、生活方式等混雜因素上具有很好的匹配性。正常對(duì)照組（60人）：男性36例，女性24例，平均年齡：57.20歲。各型消化道腫瘤患者（90人）：肝癌患者男性18例，女性12例，平均年齡：56.23歲；胃癌患者男性18例，女性12例，平均年齡：55.8歲；結(jié)直腸癌患者男性18例，

9、女性12例，平均年齡：58歲。
　　2.消化道惡性腫瘤患者氧化/抗氧化指標(biāo)的變化情況：
　　2.1 腫瘤患者血漿氧化/抗氧化水平：
　　血漿T-AOC、GSH-PX活力、MDA含量在正常對(duì)照組分別為4.22±1.21U/ml、346.00±45.34U/ml、3.06±0.59nmol/mL，消化道腫瘤組分別為0.88±0.33U/ml、240.77±44.77U/ml、4.78±1.42nmol/mL，表明消化道腫瘤

10、組血漿T-AOC、GSH-PX活力均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；血漿MDA含量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同類型消化道腫瘤患者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血漿T-AOC在胃癌（0.87±0.38U/ml）、肝癌（0.95±0.33U/ml）、結(jié)直腸癌患者（0.83±0.27U/ml）均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。血漿GSH-PX活力在胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌分別為：223.84±43.23U/ml、243.27±53.0

11、8U/ml、255.21±30.75U/ml，均顯著低于正常對(duì)照組（ P＜0.01）。血漿 MDA含量在胃癌（4.99±1.67nmol/mL）、肝癌（4.65±1.39nmol/mL）、結(jié)直腸癌（4.69±1.19nmol/mL）均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。血漿氧化/抗氧化水平在不同類型腫瘤、不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.2 消化道腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞氧化水平：
　　正常對(duì)照組外

12、周血單個(gè)核細(xì)胞ROS與線粒體ROS分別為284.69±58.89、20.91±4.19，而消化道腫瘤組分別為421.69±108.11、46.33±12.01，可見消化道腫瘤組與正常對(duì)照組相比，單個(gè)核細(xì)胞ROS與線粒體ROS均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞ROS在胃癌（422.30±110.8）、肝癌（424.58±97.39）、結(jié)腸癌（418.18±118.69）均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.

13、01）。單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS在胃癌（43.32±8.31）、肝癌（46.11±12.14）、結(jié)腸癌（49.56±14.34）均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。單個(gè)核細(xì)胞ROS與線粒體ROS含量在不同類型腫瘤、不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.消化道腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)：
　　消化道腫瘤組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)（1.12±0.56）與正常對(duì)照組（4.84±1.9

14、0）相比顯著降低（P＜0.01）。不同類型消化道腫瘤外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：胃癌（0.93±0.64）、肝癌（1.22±0.60）、結(jié)直腸癌（1.21±0.39）均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)在不同類型腫瘤間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），并且腫瘤患者單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)在不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.消化道腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線

15、粒體功能的變化情況：
　　4.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況：
　　外周血單個(gè)核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞線粒體膜電位正常對(duì)照組分別為：2809.96±311.54、1567.15±188.66、3206.51±326.87、2512.41±501.76、3127.20±458.74；消化道腫瘤組分別為：1125.88±313.99、1011.38±185.62、1480.98±352.69、129

16、0.40±340.47、1360.83±436.14，可見消化道腫瘤組不同細(xì)胞線粒體膜電位均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。胃癌組單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位（1171.94±478.86）、T細(xì)胞線粒體膜電位（1024.18±140.16）、B細(xì)胞線粒體膜電位（1545.99±67.85）、NK細(xì)胞線粒體膜電位（1358.99±481.15）、單核細(xì)胞線粒體膜電位（1381.11±514.54）與正常對(duì)照組相比均顯著下降（P＜0.01）

17、；肝癌組單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位（1053.43±196.71）、T細(xì)胞線粒體膜電位（937.30±196.55）、B細(xì)胞線粒體膜電位（1476.68±309.56）、NK細(xì)胞線粒體膜電位（1226.63±159.94）、單核細(xì)胞線粒體膜電位（1308.02±431.87）與正常對(duì)照組比較均顯著下降（ P＜0.01）；結(jié)直腸癌組單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位（1152.28±161.92）、T細(xì)胞線粒體膜電位（1072.65±194.24）、B細(xì)

18、胞線粒體膜電位（1420.28±373.64）、NK細(xì)胞線粒體膜電位（1285.57±299.30）、單核細(xì)胞線粒體膜電位（1393.36±357.93）與正常對(duì)照組相比均顯著下降（P＜0.01）。不同類型腫瘤間各細(xì)胞線粒體膜電位無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），并且腫瘤患者各細(xì)胞線粒體膜電位在不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.2 消化道腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP含量變化情況
　　外周血單個(gè)核細(xì)胞A

19、TP含量正常對(duì)照組為15.18±5.15，消化道腫瘤組為6.96±2.16 （P＜0.01）。不同類型消化道腫瘤的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)胃癌（7.34±2.05）、肝癌（6.49±2.31）、結(jié)直腸癌（7.04±2.11）ATP含量均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP含量在不同腫瘤組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），并且腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP含量在不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

20、　　結(jié)論：
　　1.消化道惡性腫瘤患者存在氧化/抗氧化失衡，表現(xiàn)為：血漿T-AOC與GSH-PX活力顯著下降；血漿MDA含量上升；外周血單個(gè)核細(xì)胞ROS含量與線粒體ROS含量均明顯升高。
　　2.消化道惡性腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體DNA的拷貝數(shù)明顯降低。
　　3.消化道惡性腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能降低，即：線粒體膜電位明顯下降，ATP合成明顯減少。
　　綜上所述，消化道腫瘤患者機(jī)體的氧化/抗氧化系