以HDAC為靶點干預(yù)消化道腫瘤的初步研究.pdf

1、研究背景:消化道腫瘤是多發(fā)的惡性腫瘤,其發(fā)病率和年輕化呈逐年增長趨勢,死亡率一直處于較高水平。腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程并且受到多重因素的影響,包括個體遺傳因素、環(huán)境因素、物理化學(xué)因素、分子生物學(xué)因素等等。在機體細(xì)胞中,維持正常功能的前提是基因有序的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,而染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變是真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的一個重要機制,如其轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生紊亂,細(xì)胞生長就會失去控制導(dǎo)致癌變。研究證明組蛋白乙酰化(histoneacetylase,HAT)與去乙酰

2、化(histonedeacetylase,HDAC)可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),染色質(zhì)上的組蛋白不僅僅是結(jié)構(gòu)的組成部分,它們在保存染色質(zhì)的動態(tài)平衡方面起著十分重要的作用,當(dāng)核小體的組蛋白乙?；癄顟B(tài)發(fā)生改變時,其特定的轉(zhuǎn)錄因子活性隨之也發(fā)生變化,從而影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。也正是這種動態(tài)平衡控制著多細(xì)胞生物在各個發(fā)育階段的表達(dá)譜。而組蛋白乙?；癄顟B(tài)是由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)協(xié)調(diào)控制。它們參與了DNA的損傷

3、修復(fù)、染色體異位、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因沉默、細(xì)胞分化與增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等多個過程。在腫瘤細(xì)胞中,越來越多的證據(jù)表明組蛋白乙酰化(HAT)與去乙?；?HDAC)表觀遺傳學(xué)改變是其發(fā)生與發(fā)展相關(guān)的重要因素。而HATs與HDACs活性發(fā)生了改變,導(dǎo)致組蛋白的異常修飾,影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵點。由于在多種腫瘤中存在HDACs的結(jié)構(gòu)或表達(dá)的異常以及組蛋白乙?；降漠惓?因此可以以此為靶點進(jìn)行腫瘤的治療。常規(guī)的治療方法因缺乏靶標(biāo)的選擇性往往

4、產(chǎn)生較為嚴(yán)重的毒副反應(yīng),極大地制約了臨床效果的發(fā)揮。而組蛋白去乙?；甘且粋€與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)且對腫瘤細(xì)胞生長調(diào)控具有普遍生物學(xué)意義的蛋白,可能可以成為一個廣譜低毒的抗腫瘤藥物的作用靶標(biāo)。
　　第一部分抑制HDAC1表達(dá)對消化道細(xì)胞生長及放射敏感性影響的探討
　　研究目的:應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),沉默消化道腫瘤細(xì)胞株中的HDAC1表達(dá)并觀察對其生物學(xué)特性的影響,進(jìn)一步探索其中的分子機制,為控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)

5、展提供新的靶點和干預(yù)思路。
　　方法及結(jié)果:
　　1.成功獲得慢病毒SiHDAC1并感染EC109細(xì)胞,采用有限稀釋法將細(xì)胞種植于96孔板培養(yǎng),獲得單克隆來源的EC109細(xì)胞。
　　2.RealtimePCR檢測mRNA水平和Westernblot檢測細(xì)胞總蛋白水平的改變,證實慢病毒LV-SiHDAC1成功干擾了EC109細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)在HDAC1受到抑制的EC109細(xì)胞周期

6、分布中,S期減少,G1期增加。且細(xì)胞的增殖活性明顯降低,差異顯著。
　　4.對慢病毒干擾的EC109細(xì)胞,采用x線進(jìn)行照射,發(fā)現(xiàn)磷酸化H2AX明顯升高,提示干擾HDAC1基因表達(dá)后DNA損傷增強。采用Annexin-V//PI染色方法檢測,發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞輻射后HDAC1干擾組凋亡增加,明顯高于正常對照細(xì)胞,提示干擾HDAC1基因表達(dá)能有效增強輻射效應(yīng)。
　　第二部分MCM-2作為HDAC抑制劑TSA對結(jié)腸癌細(xì)胞作用靶點的探討<

7、br>　　研究目的:應(yīng)用HDAC抑制劑TSA阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程,探討其與微小染色體維持蛋白(MCM家族)的相應(yīng)變化,為以其作為靶點進(jìn)行抗腫瘤治療提供新的思路及方法。
　　方法及結(jié)果:
　　1.經(jīng)Westernblot檢測TSA處理HCT116細(xì)胞后組蛋白乙?；疕3表達(dá),發(fā)現(xiàn)隨加藥后時間延長或TSA濃度增高而升高,并且通過CCK-8和Annexin-5檢測出現(xiàn)生長抑制和凋亡的情況,但是lovo組明顯低于HCT116組。同時經(jīng)w

8、esternblot發(fā)現(xiàn)caspase-3隨TSA濃度增高而表達(dá)增強,BCL-2則相反,與DNA修復(fù)相關(guān)的PARP表達(dá)也逐步增強。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)TSA處理后出現(xiàn)細(xì)胞周期分布中,G1期延長,S期減短。
　　3.采用RT2Profiler?PCR分析,發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期相關(guān)的84個基因中有34個基因表達(dá)發(fā)生了改變,其中7個高表達(dá),27個低表達(dá),其中BIRC5(survivin),CCNB1(cyclinB1),CCND

9、1(cyclinD1)和MCM家族表達(dá)下調(diào)最明顯;p16、p21、p27三個細(xì)胞周期相關(guān)蛋白明顯增強。另外發(fā)現(xiàn)以另一種HDAC抑制劑4-PBA處理HCT116和lovo后,P21表達(dá)同樣被上調(diào)。
　　4.采用定量PCR和westernblot檢測,發(fā)現(xiàn)MCM-2隨著藥物濃度的增加其表達(dá)逐漸降低,隨TSA處理時間的延長,表達(dá)不斷降低。
　　5.分三個靶點通過siRNA技術(shù)沉默MCM-2表達(dá)并成功轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)第三組

10、(Si-3)干擾效果最為明顯。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞周期中,S期明顯縮短(34.4％±3.6%vs25.0%±2.9%),G1期稍有延長(51.8%vs56.7%)。此外,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長隨劑量升高而明顯降低。
　　6.通過siRNA技術(shù)沉默HCT116細(xì)胞中MCM-2的表達(dá),與對照組相比凋亡明顯增加。westernblot結(jié)果顯示當(dāng)MCM-2沉默后凋亡明顯增加并且與劑量濃度相關(guān),同時發(fā)現(xiàn)與DNA修復(fù)相關(guān)的PARP表達(dá)明顯增強,抗