肺腺癌患者外周血單個核細胞集落培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、背景:腫瘤干細胞(TSC)學(xué)說提示腫瘤組織中存在極少部分腫瘤干細胞，其主要特點是自我更新、無限增殖的潛能和強致瘤性，腫瘤干細胞與腫瘤的發(fā)生、耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。肺癌是目前中國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌占肺癌總數(shù)的30％-40％，是肺癌最常見的組織類型之一。有研究者發(fā)現(xiàn)肺腺癌起源于氣道干細胞，氣道干細胞屬于氣道末段細支氣管肺泡導(dǎo)管連接處的細支氣管肺泡干細胞，肺腺癌被認為是一種干細胞疾病，研究者認為靶向殺滅肺癌干

2、細胞才可能是根治肺癌的有效治療手段。尤其是近10余年的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞可以扮演轉(zhuǎn)移灶的“種子”細胞角色，研究者認為“轉(zhuǎn)移腫瘤細胞=腫瘤干細胞”。目前從血液循環(huán)中檢測出腫瘤細胞已經(jīng)是被認可的臨床技術(shù)，并且可從中分離培養(yǎng)出腫瘤干細胞。雖然該技術(shù)可檢測與分離出循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)，但費用昂貴，這限制了其在科研和臨床的應(yīng)用與推廣，目前尚缺乏簡單便宜的分離培養(yǎng)方法，而且也缺乏后續(xù)干細胞擴增培養(yǎng)的技術(shù)。由于肺腺癌的腫瘤干細胞起源于正常組織的

3、干細胞，兩者生物學(xué)特性有許多相似之處，因此，本研究嘗試采用人造血干細胞甲基纖維素半固體培養(yǎng)基對肺腺癌患者外周血單個核細胞進行集落培養(yǎng)，并嘗試進行集落細胞的體外培養(yǎng)，為明確腫瘤干細胞特點提供前期實驗基礎(chǔ)。
　　目的:本研究采用人造血干細胞甲基纖維素半固體培養(yǎng)基營造干細胞集落生長環(huán)境，對肺腺癌患者外周血單個核細胞進行集落培養(yǎng)及采用DMEM培養(yǎng)基對集落細胞進行體外培養(yǎng)，以求達到以下目的:
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4、的可能性;
　　②探索采用人造血干細胞甲基纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)出非造血干細胞集落的可能性及集落培養(yǎng)的情況;
　?、厶剿鞑捎肈MEM液體培養(yǎng)基對肺腺癌患者外周血非造血干細胞集落細胞的體外培養(yǎng)情況。
　　方法:選取肺腺癌患者10例，患者病情的臨床TNM分期為T2N1M1a-T4N3M1c。對各例患者均抽取外周血10mL，利用Ficoll-PaqueTMPLUS分離出外周血單個核細胞，用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基（含重組人干細胞因子

5、等適合干細胞的生長因子）對其進行培養(yǎng)，動態(tài)觀察細胞、集落的生長情況，描述集落生長形態(tài)和生長曲線，辨析出非造血干細胞克隆類型，并挑選非造血干細胞集落進行流式細胞術(shù)檢測，檢測指標(biāo)為CD34與CD44，挑取非造血干細胞集落，機械分離后，在體外完全培養(yǎng)基條件下進行細胞傳代培養(yǎng)，并觀察其體外培養(yǎng)情況。
　　結(jié)果:本研究共進行10例肺腺癌患者外周血單個核細胞集落培養(yǎng)研究，每一份培養(yǎng)物加入細胞量為(2.2±0.149)×105個細胞，經(jīng)過2周左

6、右培養(yǎng)，每一份培養(yǎng)物的細胞集落平均為120.70±27.893個，細胞集落生長曲線顯示:在培養(yǎng)第5-7天細胞開始聚集成團狀，第8-10天小型、初步細胞集落形成，第14-16天細胞集落形成，集落類型主要為BFU-E樣、CFU-G樣和CFU-GEMM樣集落，其中，BFU-E樣與CFU-GEMM樣集落周邊出現(xiàn)“鋪路石”狀細胞集落，呈密集片狀，細胞間界限不清，挑取該細胞集落進行流式細胞術(shù)CD34與CD44雙標(biāo)檢測，發(fā)現(xiàn)該細胞群體是CD34low

7、CD44high特點的細胞群體。進一步挑取上述不同類型集落進行體外完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并連續(xù)8周觀察，均未發(fā)現(xiàn)貼壁細胞的生成與增殖。
　　結(jié)論:
　?、僭诜蜗侔┗颊咄庵苎獑蝹€核細胞中，非造血干細胞存在的可能性是有的;
　　②采用人造血干細胞甲基纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)出非造血干細胞集落的可能性非常大，可能是源于“循環(huán)腫瘤細胞”;
　?、酆芸赡艽嬖诘姆窃煅杉毎捏w外培養(yǎng)需要進一步在培養(yǎng)基成分調(diào)整、實驗技術(shù)提高的情況下進行。