肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)研究.pdf

1、研究背景與目的：結(jié)核病（TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，可侵及全身各系統(tǒng)、各臟器，其中以肺結(jié)核（PTB）最為常見。隨著HIV感染的流行、耐藥菌株的不斷出現(xiàn)以及移民和貧困等客觀因素，結(jié)核病在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了大回升，是嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。 在機(jī)體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)中單核巨噬細(xì)胞是結(jié)核桿菌的主要棲居地，也是宿主抗原提呈和抗菌的主要效應(yīng)細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞足主要的免疫調(diào)控細(xì)胞。因此，

2、從外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）研究結(jié)核病發(fā)病的機(jī)體的免疫機(jī)制具有重要的意義。 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）理論和技術(shù)的發(fā)展和完善，使人們從組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體表達(dá)水平研究疾病成為可能。以疾病病變組織或細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，能真實(shí)的反映機(jī)體疾病情況，可以為疾病的早期診斷提供新的特異性的分子標(biāo)記物，又可以同時(shí)檢測(cè)、跟蹤疾病的發(fā)展和預(yù)后情況，并為認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。因此，疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有著重

3、要的臨床意義和應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)包括雙向凝膠電泳（2-DE）和質(zhì)譜（MS）技術(shù)來(lái)分析和鑒定肺結(jié)核病患者和健康志愿者PBMC差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，為闡明結(jié)核病發(fā)病的免疫學(xué)分子機(jī)制提供新的線索，找出可能的診斷標(biāo)志物和有效治療靶點(diǎn)。 方法： 1．樣本收集處理：收集PTB患者和健康志愿者各10例，抽取外周靜脈血并用肝素抗凝，人淋巴細(xì)胞分離液（相對(duì)密度1．077）密度梯度離心分離出PBMC。提取PBMC總蛋白質(zhì)，用

4、Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。 2．蛋白分離：利用2-DE對(duì)PTB患者和健康志愿者PBMC的總蛋白進(jìn)行分離，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，掃描圖像并獲取蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜。應(yīng)用ImageMaster2D Elite6．0分析軟件對(duì)向電泳凝膠圖譜進(jìn)行分析，尋找兩組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過膠內(nèi)酶切，點(diǎn)樣，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），最后利用Mascot軟

5、件搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定明確足何種蛋白質(zhì)。 3．選取可能與PTB發(fā)病機(jī)制相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，應(yīng)用Western blot方法對(duì)差異蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1．PTB組和正常對(duì)照組各2塊凝膠間匹配點(diǎn)數(shù)為1103±25和1053±42，其平均匹配百分率分別為87．9%和86．3%；同一樣本2塊不同凝膠之間在等電聚焦（IEF）方向的平均偏差為（1．17±0．18）mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙稀酰胺凝

6、膠電泳（SDS-PAGE）方向上的平均偏差為（1．09±0．14）mm。從而建立了重復(fù)性較好的PTB患者及健康人群PBMC的雙向電泳圖譜（17cm PH3-10NL IPG膠條）。 2．對(duì)10例PTB患者和健康志愿者PBMC的雙向電泳圖譜進(jìn)行匹配分析，其平均匹配點(diǎn)數(shù)為886±17個(gè)。找出14個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在PTB組中表達(dá)上調(diào)，3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。對(duì)14個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒

7、定獲得14張蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），共鑒定出12種差異蛋白質(zhì)，通過文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)其中有2種蛋白質(zhì)可能與PTB發(fā)病相關(guān)的，分別為Coronin-1A和Pleckstrin。 3．用Western blot方法在蛋白水平對(duì)Coronin-1A和Pleckstrin的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示Pleckstrin在PTB組中表達(dá)下調(diào)，與雙向電泳的分析結(jié)果一致，Coronin-1A并沒有顯示表達(dá)量的明顯差異。 結(jié)論：

8、本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)PTB患者和健康志愿者PBMC進(jìn)行研究，建立了重復(fù)性良好的PTB患者和健康志愿者PBMC的雙向凝膠電泳圖譜，比較分析兩者蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，鑒定出14種的差異蛋白質(zhì)。參考國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的Coronin-1A和Pleckstrin可能通過對(duì)單核吞噬細(xì)胞吞噬作用的調(diào)節(jié)在PTB發(fā)病中起著重要作用；Western blot證實(shí)Pleckstrin在PTB組中表達(dá)下調(diào)；本研究為進(jìn)一步闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制提供有