鼻咽癌高癌家系外周血單個核細胞蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的：利用蛋白質(zhì)組學方法建立分辨率高和重復性好的鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照組外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)的雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)圖譜，識別鑒定其差異表達的蛋白質(zhì)。尋找鼻咽癌高癌家系鼻咽癌早期診斷、癌變機制、治療及預后監(jiān)測的外周血特異性分子標志物。
　　 方法：(

2、1)采用密度梯度離心法分離鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照組靜脈血PBMC，用改良細胞裂解液裂解PBMC，抽取其總蛋白并利用蛋白質(zhì)組學專用2-DE蛋白檢測試劑盒測定總蛋白含量。(2)利用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者(n=11)，鼻咽癌高癌家系成員(n=15)及健康對照(n=15)PBMC的總蛋白質(zhì)，先將固相化pH3-10NL梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條

3、進行第一向固相pH梯度等電聚焦((isoelectric focusing，IEF)，取出IPG干膠條經(jīng)平衡30min后進行第二向垂直十二烷基磺酸鈉聚丙烯酞胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，然后對2-DE凝膠進行藍銀染色并用LabScan掃描凝膠成像，接著采用PDQuest圖像分析軟件對2-DE凝膠圖譜依次進行蛋白質(zhì)斑點檢測、

4、背景消減、標準化、匹配、建立平均凝膠(matchset gel)、比較差異等分析并識別差異表達的蛋白質(zhì)。選取部分差異表達的蛋白質(zhì)應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)檢測得到相應的肽質(zhì)指紋圖譜，最后搜索數(shù)據(jù)庫鑒定差異蛋白質(zhì)點。
　　 結果：(1)檢測P

5、BMC總蛋白的標準曲線回歸方程為y=-0.0038X+0.4025，R2=0.9974.(2)得到了分辨率較高、重復性較好的鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者，鼻咽癌高癌家系成員及健康對照PBMC雙向凝膠電泳圖譜。鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者，鼻咽癌高癌家系成員及健康對照PBMC凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為1224±45，1249±43及1180±40；組內(nèi)的平均匹配率分別為92.8％，91.9％及91.6％。同一組內(nèi)3塊膠在第一向IEF方向上位置的偏

6、差較小，分別為1.05±0.11mm，1.07±0.13mm及1.07±0.15mm，在第二向SDS-PAGE方向上位置的偏差也較小，分別為2.05±0.20mm，1.87±0.23mm及2.03±0.22mm。
　　 (3)鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照PBMC凝膠的差異蛋白點，表達增強的個數(shù)分別是26±5，27±4及21±5，表達量降低的個數(shù)分別是13±5，18±4及15±3；隨機選取至少在50％的凝

7、膠中均有相同變化及表達量相差2倍以上的差異蛋白質(zhì)點共22個，對其進行質(zhì)譜分析，鑒定出19個蛋白質(zhì)，在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者及鼻咽癌高癌家系成員PBMC中表達明顯增強的有熱休克蛋白質(zhì)(heat shock protein，HSP)27、S100A9蛋白、Prohibitin蛋白、肌動蛋白等10個蛋白點；而Peroxiredoxin-2、6-phosphogluconolactonase等9個蛋白質(zhì)點在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者及鼻咽癌高癌

8、家系成員PBMC中低表達。這些差異蛋白質(zhì)點主要為蛋白質(zhì)合成與分解、分子伴侶、抗氧化應激、三大代謝相關酶類、細胞結構相關蛋白質(zhì)以及信號傳導相關蛋白質(zhì)等六類。
　　 結論：(1)成功地建立了用蛋白質(zhì)組學技術分析PBMC的實驗方法。
　　 (2)建立了分辨率高且重復性較好的鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照PBMC雙向凝膠電泳圖譜。
　　 (3)鑒定出差異表達蛋白質(zhì)19個，表達明顯增強有10個，明顯