外陰鱗狀細胞癌相關蛋白的蛋白質組學研究.pdf

1、前言
　　外陰癌是婦科惡性腫瘤之一，常見于60歲以上的婦女。外陰鱗狀細胞癌是外陰癌最常見的類型，占所有外陰惡性腫瘤的90％以上。目前外陰癌的病因仍不清楚，危險因素包括外陰營養(yǎng)不良（如外陰硬化性苔蘚）、外陰人乳頭瘤病毒感染史、吸煙、外陰上皮內瘤變、免疫缺陷綜合征及宮頸癌的病史等。隨著分子生物學研究進展，研究發(fā)現(xiàn)一些與外陰癌變相關的基因和蛋白，但確切的機制尚不清楚。
　　蛋白質組學是指以蛋白質組為研究對象，從整體的角度，分析細胞

2、內動態(tài)變化的蛋白質組成與活動規(guī)律。與傳統(tǒng)的單個蛋白質研究相比，蛋白質組學采用高通量的研究方法，可同時篩選多個蛋白質，在研究有關生命活動機制的基本問題方面達到了空前的規(guī)模和速度。因此，本研究利用蛋白質組學研究技術即2D-DIGE（雙向熒光差異凝膠電泳）結合MALDI-TOF/TOF（基質輔助激光解吸電離）質譜鑒定的方法篩選外陰鱗癌組織及外陰正常組織之間差異表達的蛋白質，同時運用Western blotting及免疫組化的方法對部分差異表達

3、蛋白質進行驗證，并將檢測的結果與臨床病理資料相結合進行研究，最后通過甲基化研究分析外陰鱗癌組織及外陰正常皮膚組織中Galectin-7基因啟動子甲基化的情況。
　　實驗方法
　　一、蛋白質組學
　?。ㄒ唬┛偟鞍椎奶崛?、純化及定量
　　收集外陰鱗癌組織及外陰正常組織各6例進行總蛋白質的提取。按照2DClean-up Kit蛋白質純化試劑盒的說明書對總蛋白質進行提純。按照2D Quant Kit蛋白質定量試劑盒的說明

4、書進行總蛋白質濃度的測定。
　?。ǘ╇p向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)及圖像分析
　　對提取的總蛋白進行熒光標記后進行第一向固相pH梯度等電聚焦，然后將膠條進行平衡后進行第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的膠板進行掃描后進行分析。
　?。ㄈ㎝ALDI-TOF（基質輔助激光解吸電離）質譜鑒定及生物信息學分析
　　凝膠樣品的制備及點樣后置于質譜儀中進行鑒定，通過查詢EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫對篩選出的蛋白質

5、進行生物信息學分析。
　　二、免疫組化
　　應用免疫組織化學SP法分析35例外陰鱗癌組織及10例外陰正常皮膚組織中Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1及DPT的表達情況。
　　三、Western blotting
　　應用Western blotting技術檢測10例外陰鱗癌組織及外陰正常皮膚組織中Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1及DPT的表達。
　　

6、四、臨床病理資料分析
　　對外陰鱗癌組織的免疫組化檢測結果與外陰鱗癌病例的臨床病理特征之間的關系進行研究。
　　五、甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)
　　應用MSP的方法對20例外陰鱗癌組織及12例外陰正常皮膚組織中Galectin-7基因啟動子甲基化的情況進行檢測。
　　實驗結果:
　　1、雙向熒光差異凝膠電泳中切取差異明顯的蛋白質點78個，其中共有66個得到

7、鑒定結果。除去重復的蛋白質，最終得到62個差異蛋白質。其中，在外陰鱗癌組織中表達上調的蛋白質為54個，表達下調的蛋白質為8個。
　　2、通過查詢EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫獲得62個差異蛋白的生物學功能及亞細胞定位。差異蛋白質的生物學功能多樣，其中主要包括凋亡(14.52％)，轉錄與翻譯(12.90％)，信號轉導(9.68％)，免疫反應(8.06％)，代謝酶(9.68％)，轉運(12.90％)。對62個差異蛋白的亞細胞定位進行分析，其中

8、30個位于胞漿(49.21％)。
　　3、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1，DPT陽性細胞均表達于外陰正常表皮細胞全層，呈細胞漿和細胞核陽性，在VSCC癌巢中有陽性細胞表達（其中DPT在VSCC癌巢細胞中無表達或弱表達），而間質中無表達，并且兩者之間均有顯著性差異(P＜0.05)。其中GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1在外陰鱗癌組織中顯著高表達(P＜0.05)，Galectin-

9、7及DPT在外陰鱗癌組織中顯著低表達（P＜0.05）。
　　4、Western blot檢測結果顯示高分化外陰鱗癌組織中Galectin-7及DPT的表達明顯低于外陰正常皮膚組織(P＜0.05);高分化外陰鱗癌組織中GSTP1，Prx4，CFL1及Pfn1的表達明顯高于外陰正常皮膚組織(P＜0.05)。
　　5、甲基化特異性PCR檢測外陰鱗癌組織及外陰正常皮膚組織中Galectin-7啟動子的甲基化情況發(fā)現(xiàn)在外陰鱗癌組織中G

10、alectin-7啟動子甲基化的陽性率為80.0％，在外陰正常皮膚組織中甲基化的陽性率為33.3％，兩者具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、運用蛋白質組學技術共篩選出62種差異蛋白，其中54種蛋白質在外陰鱗癌組織中表達上調，8種蛋白質在外陰鱗癌組織中表達下調。
　　2、通過驗證實驗發(fā)現(xiàn)GSTP1，Prx4，CFL1及Pfn1在外陰鱗癌組織中顯著高表達，Galectin-7及DPT在外陰鱗癌組織中顯著低