食管鱗狀細(xì)胞癌血漿腫瘤標(biāo)記物的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選及驗(yàn)證.pdf

1、研究背景：
　　食管癌（esophageal cancer，EC）是人類常見(jiàn)惡性腫瘤之一，由于其惡性程度高，5年生存率低于20％，已經(jīng)成為世界上第八大惡性腫瘤。食管癌是我國(guó)農(nóng)村發(fā)病率最高的惡性腫瘤，全球每年有約45萬(wàn)新增病例，中國(guó)每年確診的食管癌患者約占全球總數(shù)的一半，并且發(fā)病率仍在逐年升高，其中90%的食管癌病理類型是食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。
　　盡

2、管手術(shù)及輔助放化療等治療技術(shù)明顯進(jìn)步，但是 ESCC總的五年生存率仍然很低。原因在于大多數(shù) ESCC病人被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是腫瘤晚期，不適合做根治性切除術(shù)。有研究證實(shí)，早期診斷和早期治療可獲得較好的預(yù)后。而目前食管癌的早期診斷主要依靠復(fù)方碘溶液內(nèi)鏡下黏膜染色檢查，但是其靈敏度、特異性均不理想。人們十分關(guān)心腫瘤標(biāo)記物的研究和開(kāi)發(fā)，希望能夠?qū)ふ业届`敏度高、特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)記物。因此，尋找能夠有效用于 ESCC早期診斷的腫瘤生物標(biāo)記物將變得非常緊迫

3、且意義重大。
　　近年來(lái)由于分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的飛速進(jìn)步，一些與惡性腫瘤病因和發(fā)病機(jī)制相關(guān)的癌基因和抑癌基因相繼被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)于惡性腫瘤的認(rèn)識(shí)也在不斷的深化。然而基因的生物學(xué)功能并不是通過(guò)自己實(shí)現(xiàn)的，而是通過(guò)編碼的蛋白質(zhì)來(lái)執(zhí)行其生物學(xué)功能的。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展為發(fā)現(xiàn)腫瘤的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物提供新的技術(shù)平臺(tái)，也為研究惡性腫瘤的病因、發(fā)病機(jī)制、治療效果及預(yù)后奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
　　蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的實(shí)際執(zhí)行者，蛋白

4、質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)的新亮點(diǎn)，它利用了臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、質(zhì)譜分析（MS）和生物信息學(xué)等多種不同領(lǐng)域的技術(shù)工具，來(lái)共同探索和實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的分離、純化和鑒定，它是研究特定組織細(xì)胞在不同時(shí)空情況下全部蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的一種高通量平臺(tái)技術(shù)，能夠動(dòng)態(tài)、完整和定量地考察疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改變，有助于尋找到疾病診斷和治療的標(biāo)記物。
　　1997年，Unlu M結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)和特有的多重?zé)晒夥治黾夹g(shù)，研

5、究出一種新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）。將樣品在雙向電泳之前分別用三種不同熒光染料Cy2，Cy3和Cy5標(biāo)記。這三種熒光染料帶有相同的活化基團(tuán)-NHS脂，可以特異性與賴氨酸殘基的ε氨基結(jié)合，由于這三種染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，分子量接近，帶有一個(gè)正電荷，這樣蛋白質(zhì)與熒光染料結(jié)合后其等電點(diǎn)不會(huì)發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動(dòng)到相同的位置。將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品混合，在同一塊膠上進(jìn)行雙向電泳。并通過(guò)多

6、通道激光掃描凝膠圖像得到不同顏色熒光信號(hào)，根據(jù)這些信號(hào)的比例來(lái)判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。在2D-DIGE技術(shù)中，第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念，每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件全自動(dòng)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測(cè)到的蛋白豐度變化是真實(shí)的，極大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，重復(fù)性和可靠性。2D-DIGE技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準(zhǔn)確率最高的技術(shù)之一。
　　近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)有關(guān)食管癌早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)記物作了大量

7、有益的研究，有些已經(jīng)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。對(duì)食管癌患者的普查、早期診斷及預(yù)后，目前運(yùn)用到的腫瘤標(biāo)記物主要包括：癌胚抗原（CEA）、糖蛋白50（CA50）、糖蛋白242（CA242）、糖蛋白199（CA199）、組織多肽糖原（TPA）、細(xì)胞角質(zhì)蛋白（Cyfra21-1）和神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）及甲胎蛋白（AFP）等，但其靈敏度和特異性仍不是非常令人滿意。以往有關(guān)癌癥腫瘤標(biāo)記物的研究主要是利用癌癥及癌旁組織，或者永生化細(xì)胞系作為研究對(duì)象。然

8、而，血漿是機(jī)體中非常重要的組織液，血漿蛋白質(zhì)組的變化能夠在疾病發(fā)生早期來(lái)反映機(jī)體的健康狀況，并且無(wú)痛苦無(wú)創(chuàng)傷，樣品收集方便。從血漿中來(lái)尋找潛在的腫瘤生物標(biāo)記物將能夠用于腫瘤的早期診斷，因此，越來(lái)越多的研究者熱衷于從外周血中來(lái)篩選蛋白標(biāo)記物。
　　研究目的：
　　篩選并鑒定能夠用于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷用的特異性血漿腫瘤標(biāo)記物，為早期診斷ESCC提供可靠的依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.臨床標(biāo)本
　　53例

9、食管鱗狀細(xì)胞癌患者血漿標(biāo)本均來(lái)自2014年3月～2015年3月鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科住院患者，且均為患者初診時(shí)獲得，未經(jīng)手術(shù)及放化療等治療。其中ESCC組包括男性31例和女性22例，年齡50～65歲，TNM分期為T(mén)is-T1N0M0，病理學(xué)確診為食管鱗狀細(xì)胞癌。同時(shí)，隨機(jī)抽取53例正常健康組的血漿標(biāo)本，這些標(biāo)本均來(lái)自于2015年1月鄭州大學(xué)一附院體檢科健康體檢者，其中包括男性26例和女性27例，年齡50～65歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫

10、理委員會(huì)同意，且受試者均簽署了知情同意書(shū)。所有的血漿標(biāo)本晨起空腹抽血，室溫靜置1小時(shí)，3000r/min離心15min,取上清液，保存于-80℃深低溫冰箱中備用。
　　2.主要儀器和試劑
　　SIGMA ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit試劑盒、2-D Clean-up Kit試劑盒、EttanTM2-D Quant Kit試劑盒、固相化24 cm非線性干膠條、Etta

11、nTM IPGPhor等電聚焦儀、Typhoon Imager9400成像儀、ImageQuant TL軟件、DeCyder2D差異分析軟件、DeCyder V6.5分析軟件、EttanTMDALT Six垂直電泳系統(tǒng)、ABI4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀。
　　3.蛋白質(zhì)定量
　　應(yīng)用SIGMA ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit試劑盒對(duì)血漿樣品進(jìn)行處理，

12、去除白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白，使低豐度蛋白顯影增強(qiáng)。其他干擾血漿雙向電泳的物質(zhì)用2-D Clean-up Kit試劑盒去除，血漿樣本中的蛋白質(zhì)濃度用EttanTM2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒測(cè)定。
　　4.雙向熒光差異凝膠電泳制作分析膠
　　隨機(jī)抽取4例ESCC組血漿標(biāo)本及4例健康對(duì)照組血漿標(biāo)本各50μg，用Cy3或Cy5熒光染料進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。內(nèi)標(biāo)由樣品蛋白各取25混合而成，用Cy2染料進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。熒光染

13、料標(biāo)記的血漿蛋白上樣到固相化的非線性干膠條進(jìn)行水化反應(yīng)。然后應(yīng)用EttanTMIPGPhor等電聚焦儀和EttanTMDALT Six垂直電泳系統(tǒng)分別進(jìn)行第一向和第二向電泳制作分析膠。
　　5．制作制備膠
　　按照分析膠的制備步驟和參數(shù)，用膠體考染法進(jìn)行蛋白染色，將含有同等量的各組樣品蛋白混合后取800μg制作制備膠。
　　6．篩選差異蛋白質(zhì)點(diǎn)
　　用波長(zhǎng)488 nm、532 nm、633 nm的激發(fā)光分別對(duì)Cy

14、2、Cy3及Cy5進(jìn)行掃描，用Typhoon多功能掃描成像系統(tǒng)采集分析膠圖像，可以看到Cy2、Cy3及Cy5熒光染料標(biāo)記的樣本圖像顯色分別為藍(lán)色、綠色和紅色。用DeCyder V6.5分析軟件對(duì)分析膠蛋白點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和匹配，配合三維圖像及人工校對(duì)，篩選出感興趣的差異蛋白點(diǎn)，然后在制備膠上匹配到相對(duì)應(yīng)的蛋白點(diǎn)，最后使用EttanTM Spot picker全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行挖取。
　　7．差異蛋白質(zhì)的分離和純化

15、　　用胰蛋白酶對(duì)挖取的差異蛋白進(jìn)行膠內(nèi)膠粒，將酶解后的肽段用真空冷凍干燥儀凍干，然后將凍干后的酶解肽段用ZipTip試劑進(jìn)行純化和濃縮。
　　8．差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　將純化濃縮的樣品點(diǎn)到清潔干燥的MALDI樣品靶上，點(diǎn)好的樣品靶輸入質(zhì)譜分析儀中進(jìn)行質(zhì)譜分析。首先進(jìn)行內(nèi)標(biāo)校正，用強(qiáng)度為3000-4000的激光轟擊樣品，獲取肽質(zhì)量指紋圖譜，然后自動(dòng)選擇最強(qiáng)的10個(gè)母離子，用MS-MS1KV陽(yáng)離子獲取及處理方式進(jìn)行MS/MS二級(jí)

16、質(zhì)譜分析，從而得到肽序列標(biāo)簽。最后將獲取的肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列標(biāo)簽與蛋白質(zhì)序列比對(duì)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，鑒定出高度可信的差異蛋白質(zhì)。
　　9．差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析
　　取高度可信的蛋白結(jié)果進(jìn)行下一步的生物信息學(xué)分析。首先根據(jù)蛋白質(zhì)的分子功能對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行GO分類，然后利用String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)對(duì)差異蛋白進(jìn)行相互作用預(yù)測(cè)。
　　10．Western blot驗(yàn)證

17、　　隨機(jī)選取4例ESCC組血漿標(biāo)本和4例健康對(duì)照組血漿標(biāo)本，進(jìn)行Western-blot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　11．ELISA驗(yàn)證
　　隨機(jī)抽取45例ESCC組血漿標(biāo)本及45例健康對(duì)照組血漿標(biāo)本，來(lái)進(jìn)行ELISA驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　12．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所使用的統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS17.0，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，取α=0.05作為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。所有的計(jì)量資料均使用

18、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SE）來(lái)表示。
　　結(jié)果：
　　1．蛋白定量結(jié)果
　　本實(shí)驗(yàn)先用EttanTM2-D Quant Kit試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后再通過(guò)蛋白染色進(jìn)行驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。每組隨機(jī)抽取一個(gè)500μg的血漿樣本上樣跑SDS-PAGE電泳并且進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示兩組的蛋白條帶灰度值基本一致，表明該定量方法準(zhǔn)確可靠。
　　2.分析膠的熒光圖像采集
　　經(jīng)過(guò)雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）

19、、Typhoon Imager9400成像儀熒光掃描及ImageQuant TL分析軟件分析，4塊分析膠均得到了清晰的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，不同染料標(biāo)記的樣本顏色不同，Cy2的圖像為藍(lán)色、Cy3的圖像為綠色、Cy5的圖像為紅色。
　　3.分析出的差異蛋白點(diǎn)
　　用DeCyder V6.5分析軟件進(jìn)行蛋白點(diǎn)的檢測(cè)和匹配，配合三維圖像及人工校對(duì)等方法，食管鱗狀細(xì)胞癌組血漿蛋白與健康對(duì)照組相比較，共篩選到了31個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)的蛋白

20、點(diǎn)有16個(gè)，下調(diào)的蛋白點(diǎn)有15個(gè)。
　　4.差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定
　　經(jīng)過(guò)膠內(nèi)酶解，用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對(duì)31個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，將獲取的肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列標(biāo)簽與蛋白質(zhì)序列比對(duì)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，去除結(jié)果相同的蛋白質(zhì)，共鑒定出12種差異蛋白質(zhì)，表達(dá)上調(diào)的蛋白和表達(dá)下調(diào)的蛋白各6種。表達(dá)上調(diào)的蛋白為α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS-糖蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、鋅-α2-糖蛋

21、白、補(bǔ)體因子I、補(bǔ)體 C4B；表達(dá)下調(diào)的蛋白為血清白蛋白、免疫球蛋白的α2鏈 C區(qū)、α-1抗胰蛋白酶、纖維蛋白原γ鏈、觸珠蛋白、血紅蛋白α亞基。
　　5.按照分子功能對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分類
　　按照差異蛋白的分子功能對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行GO分類，可以大概把這些蛋白質(zhì)歸為以下四類，分別是炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和凝血等生理功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中占比例最大的是炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白和免疫反應(yīng)蛋白，分別為38.7%和29%，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和

22、凝血蛋白占的比例分別是19.4%和12.9%。
　　6.差異蛋白質(zhì)的相互作用分析
　　利用String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)對(duì)差異蛋白進(jìn)行相互作用預(yù)測(cè)，除了IGHA2、SERPINA3和C4B外，其他9種蛋白有可能存在直接或者間接的相互作用。
　　13．Western blot驗(yàn)證結(jié)果
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHSG和LRG在ESCC患者血漿中濃度均明顯高于健康志愿者。AHSG灰度值的平均

23、值在ESCC組升高約2.8倍左右，LRG灰度值的平均值在ESCC組升高約1.8倍左右。因此，ESCC組血漿中AHSG和LRG的WB驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果是一致的。
　　8. ELISA驗(yàn)證結(jié)果
　　ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHSG和LRG在食管鱗狀細(xì)胞癌患者（n=45）血漿中濃度均明顯高于健康志愿者，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。AHSG在健康對(duì)照組的濃度為140.9±27.3μg/ml（x±SE），在ESCC患者組血漿中濃度為3

24、08.4±62.3μg/ml（x±SE）。LRG在健康對(duì)照組的濃度為45.3±9.4μg/ml（x±SE），在ESCC患者組血漿中濃度為118.1±24.3μg/ml（x±SE）。Levene方差齊性檢驗(yàn)顯示兩組數(shù)據(jù)方差齊性，采用兩獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，P＜0.05，ESCC組和健康對(duì)照組血漿相比，AHSG和LRG的濃度均存在顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)共篩選出12種與ESCC早期診斷相關(guān)的血漿差異蛋

25、白質(zhì)，這些差異蛋白有可能成為潛在的血漿腫瘤標(biāo)志物；
　　2.α2-HS-糖蛋白和富含亮氨酸的α2糖蛋白有可能成為ESCC潛在的血漿腫瘤標(biāo)記物，為ESCC的早期診斷提供新的機(jī)遇，但是仍需要擴(kuò)大樣本量來(lái)確定其敏感度和特異性；
　　3.α2-HS-糖蛋白和富含亮氨酸的α2糖蛋白可能與ESCC的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，尚待進(jìn)一步研究；
　　4.本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用了2D-DIGE技術(shù)，MALDI TOF/TOF質(zhì)譜分析技術(shù)和生物信息學(xué)分析