CNS脫髓鞘疾病生物標(biāo)記物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、CNS脫髓鞘疾?。–entral nervous system demyelinative diseases）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性、多灶性脫髓鞘為主的自身免疫系統(tǒng)疾病，以反復(fù)發(fā)作，多次緩解、復(fù)發(fā)為特征。病灶以主要累及大腦、腦干、小腦為主的稱為多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）。以主要累及視神經(jīng)和脊髓為主的稱為視神經(jīng)脊髓炎（Neuromyelitis optica， NMO）。 MS是涉及到神經(jīng)系統(tǒng)的最普通

2、的自身免疫性疾病，是一種影響神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)且導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)功能異常的慢性疾病。MS的病理學(xué)標(biāo)志是腦和脊髓的脫髓鞘斑的發(fā)現(xiàn)，并伴有神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、脫髓鞘、星形神經(jīng)膠質(zhì)增生以及相應(yīng)的軸突損傷。這些癥狀主要是由于軸突脫髓鞘，從而抑制或阻礙傳導(dǎo)造成的。局部髓鞘再生和炎癥的消退有助于癥狀的改善。 NMO，也稱Devic's綜合癥，是一種感染視神經(jīng)和脊髓的炎性脫髓鞘疾病，它不同于MS，沒有侵及到大腦，視神經(jīng)和視交叉為本病最多見

3、的病變部位，偶可累及視束。NMO是一種可以致殘以至危及生命的疾病。預(yù)后較差，一半以上的病人在病情發(fā)作5年內(nèi)將發(fā)展為雙側(cè)視力受損甚至至少一眼完全失明，亦或失去行走能力。 CNS脫髓鞘疾病嚴(yán)重危害人體健康，至今仍沒有特異性的生物標(biāo)記物對其診斷治療。 腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）是存在于腦室及蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)的一種無色透明液體，含有一些小分子物質(zhì)如鹽和肽，蛋白質(zhì)，酶等。這些物質(zhì)的變化包括濃度、蛋白和肽

4、的修飾等都能夠精確反映神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。CSF的異常變化是CNS脫髓鞘疾病的特點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是指一個細(xì)胞或一個組織/體液基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在生命活動中發(fā)揮了重大的作用，蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以為疾病的發(fā)病機(jī)制已及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)提供一定啟示。CSF蛋白質(zhì)組學(xué)是研究CSF中蛋白質(zhì)表達(dá)的一項(xiàng)有效的技術(shù)手段，為研究CNS疾病的病理生理機(jī)制提供了重要信息。 本研究以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為平臺，通過雙向

5、電泳分離技術(shù)、質(zhì)譜鑒定技術(shù)、ELISA、Western blot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖譜的建立，比較CNS脫髓鞘疾?。ǘ喟l(fā)性硬化和視神經(jīng)脊髓炎）組腦脊液與對照組（其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病）腦脊液的蛋白質(zhì)組的變化，尋找與該疾病的發(fā)生機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)記物，以期從蛋白質(zhì)及分子水平探討其發(fā)病的機(jī)理，為臨床診斷、預(yù)后及治療提供有力的理論依據(jù)。 目的：通過對CNS脫髓鞘疾病患者腦脊液進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及生物信號網(wǎng)絡(luò)分析，探索與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛

6、在生物標(biāo)記物以及生物標(biāo)記物與該疾病間的關(guān)系，為其發(fā)病機(jī)理的探索、臨床診斷和治療提供依據(jù)。 方法：分別收集CNS脫髓鞘疾病組和對照組腦脊液，冰丙酮沉淀法提取總蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組，ImageMaster2D圖像分析軟件篩選出表達(dá)有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）得到肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），搜索SWISSPROT數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行鑒定。以表達(dá)顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)為研究目標(biāo)，

7、從中挑選個別蛋白進(jìn)行ELISA、Western blot定量和半定量驗(yàn)證，MetaCore，PathwayStudio軟件對表達(dá)顯著的蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析。 結(jié)果：分別獲得MS患者及對照組腦脊液蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜，8個蛋白質(zhì)點(diǎn)在兩組凝膠圖譜上存在明顯差異，4個點(diǎn)在MS組顯著上調(diào)，4個點(diǎn)下調(diào)，其中Cystatin C的ELISA結(jié)果為：（MS組4．36±1．22mg/L；對照組6．00±1．68mg/L，P<0．01）。對表達(dá)顯著的蛋

8、白質(zhì)成功構(gòu)建了MetaCore信號網(wǎng)絡(luò)圖譜。 NMO患者及對照組腦脊液蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜中，13個蛋白質(zhì)點(diǎn)在兩組凝膠圖譜上存在明顯差異，4個點(diǎn)在NMO組顯著上調(diào)，9個點(diǎn)下調(diào)，對Vitamin D binding protein（DBP）進(jìn)行了Western blot半定量驗(yàn)證。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖譜表達(dá)了蛋白質(zhì)點(diǎn)之間的生物學(xué)關(guān)系。 結(jié)論：蛋白質(zhì)的差異表達(dá)及其生物信號網(wǎng)絡(luò)研究有助于在分子水平上對CNS脫髓鞘疾病的發(fā)病機(jī)理、鑒別診斷