消化系疾病病證結合唾液蛋白質組學初步研究.pdf

1、目的: 應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術，選擇西醫(yī)病種胃癌（GC）患者、消化性潰瘍（PU）患者及慢性胃炎（CG）患者，根據舌苔及病證結合分組，并與同齡正常組對照，進行唾液蛋白質組學的研究，以闡明脾虛證與腎虛證在蛋白質組水平上的唾液特異性微觀特

2、征，并應用生物信息學手段篩選證候最優(yōu)化蛋白質組合并初步建立脾虛、腎虛病證結合診斷模型；并從蛋白質組水平初步探討中醫(yī)同病異證、異病同證的現(xiàn)代科學基礎；同時，建立具有中醫(yī)特色的唾液蛋白質組無創(chuàng)傷診斷技術，推動促進微觀辨證學的發(fā)展和中醫(yī)診斷學的現(xiàn)代化。 方法: 采集95例唾液標本，其中正常對照者20例均為健康體檢正常者，胃癌患者34例，消化性潰瘍患者20例，慢性胃炎患者21例。所有疾病患者均經過胃鏡和/或術后組織病理檢測明確診

3、斷。按病證結合分為以下三大組：（1）異病異證分組：即以證候為綱進行分組，全部病例按虛證辨證標準分為脾虛、腎虛、其他證候3組與正常組進行比較研究。（2）同病異證分組：將胃癌分別按虛證辨證標準分為脾虛、腎虛、其他證候3組與正常組進行比較研究。（3）西醫(yī)病種分組：比較正常對照者與3種疾病及疾病之間蛋白質表達譜的差異。（4）按不同舌苔分組：比較正常薄白苔與三種病理舌苔之間蛋白質表達譜的差異。采用德國BRUKER公司的WCX磁珠及Autoflex

4、Ⅲ MALDI-TOF質譜儀對全部患者和正常人的唾液進行蛋白質表達譜的檢測。設定所有唾液樣本檢測的蛋白質采集相對分子量范圍為1000～10000Da。所得到的蛋白質以肽質量指紋圖（PMF）的形式表示。然后使用BRUKER公司的數據分析系統(tǒng)（其中包括一個配套的標峰和校正峰的軟件FlexAnalysis3.0和統(tǒng)計學分析軟件ClinProTools2.1）對每個組合內的相同質荷比不同含量的蛋白進行分析比較，找到組合內蛋白含量有顯著差異的質荷

5、比峰。將組合內含量有顯著差異（P<0.05）的蛋白質波峰建立分類預測模型，選擇相應條件，用統(tǒng)計分析軟件ClinProTools2.1對其進行分組統(tǒng)計，從而得到各組的特異性蛋白標志物并初步建立相應疾病、證候及病證結合的唾液蛋白質組診斷模型。用隨機抽樣方法（隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，共運行十次），驗證模型的有效性（平均特異性、靈敏性及平均準確率）。用SPSS13.0軟件進行各組基線值的比較，年齡的比較采用單因素方

6、差分析，所有數據用x±s表達，性別構成的比較采用X2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果: 1.按異病異證分組：將所有患者分為脾虛、腎虛、其他證候3組加上正常組共79例樣本，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析比較，共得到蛋白質峰為175個，其中通過遺傳算法找到了10個差異顯著的蛋白峰，其質荷比（m/z）分別為：7447.22Da、3963.26Da、7911.59Da、1390.85Da、6574.69Da、1167

7、.54Da、1230.73Da、7846.3Da、2724.41Da、2223.89Da。在此基礎上建立了分類預測模型，識別率為89.15%，預測能力38.63%?；卮鷻z驗結果正常組19例全部被準確檢出，19例脾虛患者，其中16例被準確檢出，21例腎虛患者，有18例被準確檢出，20例其他證候患者，有17例被準確檢出。該模型的準確率為88.61%（70/79）。 2.按同病異證分組：胃癌脾虛、胃癌腎虛、胃癌其他證候3組和正常組共4

8、8例，對樣本檢測質譜圖進行分析比較，共得到蛋白質峰為161個，其中通過遺傳算法找到10個差異顯著的蛋白峰，質荷比（m/z）：8840.72Da、3442.42Da、4120.81Da、3492.63Da、6558.43Da、5583.29Da、3286.1Da、4419.3Da、5527.57Da、3923Da。通過分析差異蛋白建立了分類預測模型，識別率為80.97%，預測能力33.47%：回代檢驗結果正常組19例，其中17例被準確檢出

9、，10胃癌脾虛患者全部被準確檢出，11例胃癌腎虛患者，其中7例被準確檢出，其他證候組8例，有6例被準確檢出，該模型的準確率為83.33%（40/48）。 3.按西醫(yī)病種分組：①正常對照組與胃癌組兩組樣本共41例，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質峰為74個，其中14個統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），選擇質荷比（m/z）為1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da這四個

10、蛋白質峰進行建模。其中發(fā)現(xiàn)胃癌患者1472.78Da峰處顯著高于正常人。通過對這4個蛋白峰的鑒別，建立了分類預測模型，識別率為97.83%，預測能力79.82%。臨床回代檢驗結果，23例胃癌患者中有22例被準確檢出為胃癌，18例正常組中所有18例全部被確定為非胃癌。結果表明，該診斷模型的準確率為97.56%（40/41），靈敏度為95.65%（22/23）特異度為100%（18/18）。②正常對照組與慢性胃炎組兩組樣本共32例，對所有的

11、樣本檢測質譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質峰為74個，其中5個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），選擇質荷比（m/z）為：5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da這3個相關蛋白峰建立分類預測模型，識別率為91.67%，預測能力73.33%。臨床回代檢驗結果14例慢性胃炎患者全部被準確檢出，18例正常組對照者，其中15例被正確檢出，該模型的準確率為90.63%（29/32），靈敏度為100%（14/14），特異度

12、為83.33%（15/18）。③正常對照組與消化性潰瘍組兩組樣本共35例，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析比較，兩組共得到66個蛋白質峰，其中10個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），選擇質荷比（m/z）為：2934.36Da、5502.38Da和3472.94Da這3個相關蛋白峰，通過分析這些差異蛋白表達譜建立了分類預測模型，識別率為88.40%，預測能力80.35%。臨床回代檢驗結果17例消化性潰瘍，其中14例被準確檢出，18例正

13、常組對照者，其中17例被正確檢出，該模型的準確率為88.57%（31/35），靈敏度為82.35%（14/17），特異度為94.44%（17/18）。④慢性胃炎組與胃癌組兩組樣本共37例，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析比較，兩組共得到77個蛋白質峰，其中1個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰，質荷比（m/z）為：6021.72Da。通過分析這個差異蛋白表達譜建立了分類預測模型，其識別率為83.54%，預測能力為60.23%。⑤慢性胃炎組與消化性潰瘍

14、組兩組樣本共29例，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質峰為79個，運用統(tǒng)計分析軟件ClinProTools得出了最適宜的區(qū)分模式模型，該模型包括了4個相關峰，質荷比分別為：3369.79Da、3472.13Da、2900.2Da和3489.29Da，通過分析這些差異蛋白表達譜，并建立了分類預測模型，該模型的識別率92.86%，模型預測能力56.87%。⑥消化性潰瘍組與胃癌組樣本共42例，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析

15、比較，兩個組共得到蛋白質峰為77個，差異蛋白的分析建模有待進一步進行。 4.按舌苔分組：正常薄白苔與三組病理舌苔（包括病理薄苔、病理厚苔和病理剝苔）共75例，對所有的樣本檢測質譜圖進行分析比較，共得到蛋白質峰為187個，其中4個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），質荷比分別為：6447.39Da、2938.47Da、1472.34Da、1451.77Da，通過分析這些差異蛋白峰表達譜，并建立了分類預測模型，識別率為85.31

16、%，預測能力39.91%。對正常組19例，有18例被準確檢出，56例病理組，其中40例被準確檢出，該模型的準確率為85.33%（64/75）。 結論： 本研究利用MALDI-TOF-MS技術對健康對照組、胃癌組、消化性潰瘍組和慢性胃炎組患者的唾液中的蛋白質進行表達譜的檢測，從唾液蛋白質組初步篩選出了可用于臨床病證結合診斷的特異生物標記物，并探索建立了相關病證結合的診斷模型。該方法與傳統(tǒng)疾病生物標志物相關的檢測方法比較，具