蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析妊娠期高血壓孕婦尿液分子標(biāo)記物的研究.pdf

1、一、研究背景:
　　1.妊娠期高血壓
　　妊娠期高血壓(Gestational hypertension)是妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy)的一種,是妊娠期特有的以血壓升高為主要臨床特征的一種疾病,單純而嚴(yán)重的妊娠期高血壓孕婦,雖無(wú)蛋白尿,母兒患病率較高,甚至高于輕度子癇前期患者[1]。臨床上約25％～50%最開(kāi)始診斷為妊娠期高血壓者,可以進(jìn)展為子癇

2、前期-子癇,并且妊娠期高血壓的發(fā)病越早,其進(jìn)展為子癇前期-子癇的可能性越大,可導(dǎo)致孕產(chǎn)婦腦血管意外、子癇、圍產(chǎn)兒早產(chǎn)、甚至死亡等不良妊娠結(jié)局,其對(duì)孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒造成的危害日益受到人們的認(rèn)識(shí)和關(guān)注;在我國(guó),妊娠期高血壓疾病是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一,嚴(yán)重危害母嬰健康[2]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)免疫、基因等方面的研究,對(duì)妊娠期高血壓疾病的某些發(fā)病因素有所了解,但其發(fā)病機(jī)理仍未全面闡明,也缺乏有效、全面的特異性檢測(cè)指標(biāo)和方法,用

3、于預(yù)防、早期篩查該疾病,以及預(yù)測(cè)其嚴(yán)重程度[3,4]。因此尋求妊娠期高血壓疾病特異性的分子標(biāo)記物,進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制,實(shí)現(xiàn)早期診斷及預(yù)測(cè)妊娠期高血壓疾病是近年來(lái)產(chǎn)科研究的熱點(diǎn)。
　　2.蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法
　　蛋白質(zhì)組學(xué)是以一個(gè)細(xì)胞、組織或體液中,全部表達(dá)的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象;是當(dāng)前生命科學(xué)研究中的前沿領(lǐng)域,是實(shí)現(xiàn)機(jī)體蛋白質(zhì)的全面、快速、準(zhǔn)確的鑒定研究中必不可少的關(guān)鍵性技術(shù)之一。機(jī)體內(nèi)細(xì)胞或組織等內(nèi)的蛋白質(zhì)組細(xì)微的變化,就可

4、以引起機(jī)體內(nèi)某些重要通路的抑制或激活,進(jìn)而可能導(dǎo)致細(xì)胞的變異或者分裂,蛋白質(zhì)組作為機(jī)體一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的系統(tǒng),蛋白質(zhì)豐度的變化,是許多諸如心血管疾病、癌癥等疾病發(fā)病過(guò)程中的重要標(biāo)志,研究病變細(xì)胞相對(duì)于機(jī)體正常細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的變化,發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷及早期預(yù)測(cè),具有十分重要的意義[5]。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床方面,可以研究特異蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系,從而找到疾病的標(biāo)記蛋白,為臨床提供新的診斷依據(jù)[6]。蛋白質(zhì)組學(xué)的特

5、點(diǎn)是采用高通量的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),結(jié)合高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù),全面地研究在生理及病理等各種特定情況下,機(jī)體動(dòng)態(tài)表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的整體變化。
　　3.蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床中的應(yīng)用
　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,在臨床領(lǐng)域中還僅僅局限于篩選疾病相關(guān)的特異性標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最多是在腫瘤相關(guān)方面,蛋白質(zhì)組學(xué)不僅為其提供了一個(gè)新的方法以研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制,而且利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜可以進(jìn)行腫瘤的早期診斷及判斷患者的預(yù)后,判斷有些特異體質(zhì)的

6、患者治療后的機(jī)體反應(yīng),用于判斷機(jī)體的耐藥性。另外,蛋白質(zhì)組學(xué)也較多的應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)中。通過(guò)比較正常細(xì)胞與疾病細(xì)胞中的蛋白質(zhì)組,尋找一些疾病相關(guān)的蛋白質(zhì),并將這些蛋白質(zhì)作為疾病診斷的的關(guān)鍵點(diǎn)。國(guó)內(nèi)研究學(xué)者[7]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,分析正常4例人尿液蛋白質(zhì)組成成分,初步建立了正常人尿液的蛋白質(zhì)圖譜,為分析病理情況下尿液蛋白質(zhì)成分的改變提供了基礎(chǔ)資料,為今后研究病理情況與生理情況下尿液蛋白質(zhì)組的差異提供依據(jù)。俞麗麗等[8]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法

7、,建立了妊娠期高血壓疾病與正常妊娠孕婦的血清蛋白質(zhì)譜圖,進(jìn)一步比較兩組,發(fā)現(xiàn)二者之間存在差異的5個(gè)質(zhì)荷比相對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì),這5個(gè)質(zhì)荷比相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)有可能成為早期篩查妊娠期高血壓疾病的血清學(xué)標(biāo)志物。國(guó)外研究者[9]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立了檢測(cè)早期卵巢癌的血清蛋白質(zhì)圖譜;國(guó)外學(xué)者[10]篩選了葡萄胎組織的蛋白質(zhì)圖譜,發(fā)現(xiàn)3種金屬結(jié)合多肽的表達(dá)量明顯少于對(duì)照組。研究也發(fā)現(xiàn)[11]在胎膜早破患者血清蛋白質(zhì)圖譜中,發(fā)現(xiàn)了兩種未知功能的蛋白質(zhì),認(rèn)為這

8、兩種未知蛋白質(zhì)可能是胎膜早破診斷的特異性生物標(biāo)志物。
　　4.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜
　　在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,生物質(zhì)譜已成為蛋白組大規(guī)模分析的強(qiáng)有力工具,是近年來(lái)新興的一種技術(shù),應(yīng)用日益廣泛?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的,新型的軟電離生物質(zhì)譜的一種,主要由基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)及飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)兩部分組成。MALDI-TOF-MS具有特異度高、靈敏度高及分辨率高等

9、特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外眾多研究者,應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù),發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)疾病診斷、治療以及預(yù)后有重要作用的疾病標(biāo)志物[12-15]。為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段,扮演著越來(lái)越重要的作用。
　　5.尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的優(yōu)勢(shì)
　　臨床上尿液與羊水、胎盤(pán)等其他體液樣本相比,蛋白組成相對(duì)簡(jiǎn)單、易于分析,且尿液獲得相對(duì)無(wú)創(chuàng)、收集便利,并能在一定程度上,反映血液和整個(gè)機(jī)體的狀態(tài),同時(shí)尿液的復(fù)雜度低于血液等樣品,更容易

10、觀察其中的低豐度蛋白的變化,有利于疾病標(biāo)志物的檢出[16],是疾病重要的標(biāo)志物來(lái)源?！澳虻鞍踪|(zhì)組學(xué)”(urinaryProteomic)運(yùn)用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),實(shí)現(xiàn)了尿液蛋白質(zhì)全面的、準(zhǔn)確及快速的分析,鑒定出差異蛋白;研究尿液蛋白質(zhì)成分的改變,還可用于解釋生理學(xué)代謝、毒理及許多疾病的進(jìn)展過(guò)程,有助于闡明疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。鑒于尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的以上優(yōu)點(diǎn),國(guó)內(nèi)外學(xué)者目前熱衷于對(duì)生理和疾病狀態(tài)下的尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)

11、分析,獲得了正常人尿液的標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖譜[17,18]、并研究機(jī)體尿液蛋白在不同疾病狀態(tài)下的整體變化[19-21]。
　　應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床方面可以研究特定蛋白與疾病的關(guān)系,從而找到疾病標(biāo)記蛋白,為臨床提供新的診斷依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)方法中基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間/飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)具有靈敏度高、特異度高等優(yōu)越性。臨床上尿液與血清等其他體液樣本相比,其獲取無(wú)創(chuàng)、收集便利,蛋白組成分相對(duì)簡(jiǎn)單、易于分析。國(guó)內(nèi)外

12、學(xué)者也做了大量尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究[22-24],技術(shù)相對(duì)成熟。在此研究背景下,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)技術(shù),對(duì)妊娠期高血壓孕婦和正常孕婦尿液蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析。
　　二、研究目的:
　　旨在篩選妊娠期高血壓孕婦尿液中的特異性生物標(biāo)志物,建立正常孕婦及妊娠

13、期高血壓孕婦尿液蛋白質(zhì)指紋圖譜模型,并探討其意義。如果在早孕期間,這些蛋白質(zhì)有表達(dá)并能夠檢測(cè)出來(lái),則有利于妊娠期高血壓高危人群的早期篩查,為早期篩查妊娠期高血壓提供思路和方法。如果進(jìn)一步研究這些蛋白質(zhì)的功能,有可能闡明妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)理。初步探討這些差異蛋白是否可以作為妊娠期高血壓的生物標(biāo)志物,甚至是妊娠期高血壓疾病的診斷標(biāo)志物,尋找與妊娠期高血壓疾病診斷相關(guān)的疾病標(biāo)志物,以后將其運(yùn)用于早期診斷妊娠期高血壓疾病。
　　三、材料

14、與方法:
　　1.妊娠期高血壓與正常妊娠孕婦尿液蛋白質(zhì)組分析
　　1.1、實(shí)驗(yàn)分組
　　選擇2011年9～12月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院住院的孕晚期孕婦共20例。正常健康足月妊娠孕婦10例,妊娠期高血壓組10例,妊娠期高血壓診斷參考第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》,(妊娠期高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn):妊娠期首次出現(xiàn)BP≥140/90mmHg,并于產(chǎn)后12周恢復(fù)正常,尿蛋白(-),少數(shù)患者可伴上腹不適或血小板減少,產(chǎn)后方可確診),入選對(duì)象

15、均排除其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。各組孕婦之間年齡、孕周、孕產(chǎn)次均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　1.2、實(shí)驗(yàn)方法
　　尿液樣品經(jīng)濃縮、蛋白純化后蛋白定量分析,建立熒光差異凝膠雙向電泳(DIGE)圖譜;DeCyderV6.5分析軟件篩選差異蛋白質(zhì);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定,通過(guò)Mascot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。
　　2.激肽原1在妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的表達(dá)<

16、br>　　2.1、實(shí)驗(yàn)分組
　　選擇2012年2～6月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院住院的妊娠期高血壓疾病組60例(妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組孕婦各20例)及正常妊娠對(duì)照組尿液20例,入選對(duì)象均排除其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。各組孕婦之間年齡、孕周、孕產(chǎn)次均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.2、實(shí)驗(yàn)方法
　　蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中的差異蛋白激肽原1,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定妊娠期高血壓疾病各組與正常妊娠組尿液中激肽原1

17、含量。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　四、結(jié)果:
　　1.妊娠期高血壓與正常妊娠孕婦尿液蛋白質(zhì)組分析
　　利用Image Master 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)、圖像的強(qiáng)度校正、匹配等分析,根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),以1.5倍為標(biāo)準(zhǔn),妊娠期高血壓與正常妊娠組相比(G/N),共檢測(cè)出45個(gè)差異點(diǎn);對(duì)45個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解、MALDI

18、-TOF/TOF分析,通過(guò)Mascot軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白,妊娠期高血壓和正常對(duì)照組的尿液總蛋白含量相比(G/N),去除未鑒定出來(lái)和鑒定結(jié)果相同的蛋白,共鑒定出22種蛋白質(zhì),其中上調(diào)的蛋白有L-型前列腺素D合成酶等14種,下調(diào)的有激肽原1等8種;蛋白評(píng)分為100%,鑒定結(jié)果高度可信。
　　2.激肽原1在妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的表達(dá)
　　激肽原1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),妊娠期高血壓疾病各組較正常妊娠組

19、尿液中激肽原1含量下降,P<0.05,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　五、結(jié)論:
　　應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功篩選出妊娠期高血壓孕婦與正常孕婦尿液中存在激肽原1等22種差異蛋白,并運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)驗(yàn)證了妊娠期高血壓疾病(妊娠期高血壓、輕度子癇前期、重度子癇前期)及正常妊娠對(duì)照組孕婦尿液中激肽原1含量,其中妊娠期高血壓組與正常妊娠組結(jié)果與蛋白質(zhì)組