精索靜脈曲張患者不育標(biāo)記物的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選及驗(yàn)證.pdf

1、研究背景及目的：近年來，男性不育的發(fā)病率逐年上升。造成男性不育的因素眾多，精索靜脈曲張是最常見的原因之一。盡管精索靜脈曲張對患者的生育能力有明顯影響已成為醫(yī)學(xué)界的共識，但是其造成不育的具體機(jī)制仍不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張可能導(dǎo)致睪丸溫度調(diào)節(jié)功能障礙，從而造成慢性缺氧和活性氧物質(zhì)過度產(chǎn)生，使生精細(xì)胞在精子生發(fā)階段呈現(xiàn)出特異性凋亡。蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種前沿的研究方法，能夠在分子水平對細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)功能和代謝過程進(jìn)行精細(xì)研究。同位素

2、標(biāo)記的相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）已在科研領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在對不同疾病狀態(tài)下男性不育蛋白的研究中具有較高的價(jià)值。精漿的來源是男性前列腺、精囊腺、尿道球腺、附睪等腺體的分泌物，其主要成分為脂質(zhì)、碳水化合物、大量多肽和蛋白質(zhì)等，因此，精漿中高濃度的組織特異性蛋白可以作為男性生育能力評估的生物學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)基于先前的研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步對精漿蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，旨在篩選出在精索靜脈曲張并不育患者和正常人間具有明顯差異性的蛋白質(zhì)。通過對差

3、異蛋白進(jìn)行分子功能的研究，深入探討精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的分子機(jī)制。同時(shí)，對篩選出的差異蛋白進(jìn)行蛋白印跡(western bolt)驗(yàn)證，獲取精索靜脈曲張致不育的蛋白標(biāo)記物，為臨床中的診斷和治療提供支持。
　　實(shí)驗(yàn)方法：收集左側(cè)精索靜脈曲張不育患者20份精液樣本以及20份正常生育男性精液樣本，提取精漿作為實(shí)驗(yàn)樣本。使用同位素標(biāo)記的相對和絕對定量技術(shù)，研究樣本使用iTRAQ試劑盒標(biāo)記，117標(biāo)記精索靜脈曲張不育患者組的精漿、114

4、標(biāo)記正常生育者組的精漿，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析。使用Proteome Discoverer1.3軟件對得到的質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對差異表達(dá)蛋白選擇上調(diào)倍數(shù)≥1.5，下調(diào)差異倍數(shù)≤0.7，P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對差異蛋白進(jìn)行基于基因本體的分子功能的富集進(jìn)行分析，并從獲得的差異蛋白中挑選可以作為不育標(biāo)記物的蛋白。精索靜脈曲張不育組和正常生育組中的精漿樣本進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，使用image pro plus7.0軟件對得到的圖像進(jìn)行灰

5、度分析，以對獲得的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：鑒定出差異表達(dá)蛋白共39個(gè)，其中上調(diào)蛋白22個(gè)，下調(diào)蛋白17個(gè)。分子功能分析得出差異蛋白的分子功能共有14種，其中主要體現(xiàn)在蛋白結(jié)合、催化活性及結(jié)構(gòu)分子活性方面。C2 domain-containing protein2（C2CD2）和actin-binding LIM protein3（LIM3）在精索靜脈曲張患者中分別上調(diào)了2.532倍，2.162倍，而echinoder

6、m microtubule-associated protein-like1（EML1）下調(diào)了0.544倍。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證C2CD2、LIM3較正常組表達(dá)明顯增高，EML1較正常組表達(dá)降低。
　　結(jié)論：精索靜脈曲張潛在致病蛋白主要通過影響蛋白結(jié)合、催化活性及結(jié)構(gòu)分子活性誘發(fā)男性不育。C2CD2、LIM3、EML1三個(gè)蛋白的異常表達(dá)與精索靜脈曲張并不育具有顯著相關(guān)性，可以初步作為精索靜脈曲張患者的不育標(biāo)記物。iTR