肝細胞癌轉(zhuǎn)移特性的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是威脅我國人民健康的重大疾病。在世界范圍內(nèi)，肝細胞癌居于男性患者癌癥發(fā)病率的第五位和死亡率的第二位，發(fā)展快，惡性程度高，預(yù)后差，素有癌癥之王的稱號。世界范圍內(nèi)，每年新增的肝細胞癌患者約為700,000例，主要集中在中國、東南亞地區(qū)以及撒哈拉以南的非洲國家，呈現(xiàn)顯著的地域分布的特征。在肝癌的致病因素中，乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是最重要的誘

2、發(fā)因素。病因統(tǒng)計顯示54％的肝癌患者與HBV的感染相關(guān)，而我國又是HBV感染高發(fā)區(qū)。由HBV感染所誘發(fā)引起的肝細胞癌的發(fā)病率占到男性癌癥發(fā)病率的7.5%和死亡率的5%。因此肝細胞癌的診斷與治療是中國亟待解決的重大安全衛(wèi)生問題。
　　當(dāng)前，肝癌的臨床治療包括根治性切除、移植、組織消融治療等一系列治療方法。雖然這些治療方法為肝細胞癌的治療帶來了一些希望，但肝細胞癌其本身的異質(zhì)性、復(fù)雜性仍舊給研究、治療肝細胞癌也帶來了巨大的困難。當(dāng)前面

3、臨兩個亟待解決的問題是早期正確、特異、高效診斷的困難和經(jīng)肝癌的根治性切除后患者的高復(fù)發(fā)率的問題。早期的肝細胞癌患者具有更好治療效果，能夠顯著提高肝癌患者的生存率并降低肝細胞癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率，故早診是應(yīng)對肝細胞癌的重要途徑之一。而目前常用的肝細胞癌的早期診斷的診斷標志物例如甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein,AFP）仍有部分假陽性或假陰性的問題，故肝細胞癌的早期診斷和精準分期急需尋找新的、基于信號通路的特異性好、靈敏度高的生物

4、標志物或其組合。
　　現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一般認為，癌癥的發(fā)生是由于機體內(nèi)的基本細胞調(diào)控機制出現(xiàn)缺陷而導(dǎo)致的疾病。這種調(diào)節(jié)機制的喪失會導(dǎo)致細胞分裂和增殖的失控、細胞贅生以及轉(zhuǎn)移等癌癥疾病表型的發(fā)生。蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)與腫瘤的這些行為的深層機制密切相關(guān)。在細胞內(nèi)，泛素蛋白酶體途徑通過對某些蛋白的降解的調(diào)控，在多種細胞進程中均起到至關(guān)重要的作用。癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個長時間、多進程的遞進過程。而泛素蛋白酶體系統(tǒng)是一個多因子、多步驟的蛋白質(zhì)降解調(diào)控體

5、系，對這個體系中的不同因子的調(diào)控，是改變腫瘤發(fā)展進程的重要的措施。對肝細胞癌中泛素蛋白酶體途徑的變化的研究也是肝細胞癌病理及治療方法研究的熱點之一。
　　本研究利用了實驗室成熟的高覆蓋度、高靈敏度、高精度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，對不同轉(zhuǎn)移能力的肝細胞癌患者的組織樣本以及不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞系樣本進行研究，探索肝細胞癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機理，發(fā)現(xiàn)存在顯著差異或失調(diào)的信號通路，以及在侵襲與轉(zhuǎn)移過程中肝癌細胞中蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的變化或失

6、調(diào)，從而發(fā)現(xiàn)肝細胞癌在侵襲與轉(zhuǎn)移過程中的細胞內(nèi)各種進程發(fā)生的變化，為探索肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供幫助。
　　我們首先選取了根據(jù)肝癌TNM分型表征進行分期的不同病程階段三組明確的肝癌標本，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)進行了系統(tǒng)的高覆蓋定量蛋白質(zhì)組學(xué)組研究。我們共鑒定4620個蛋白質(zhì)，總定量蛋白數(shù)為3781。T1期癌組織與T1期癌旁組織相比，共篩選到差異表達蛋白330個，其中表達上調(diào)，而表達下調(diào)的蛋白有198個。T2期癌組織與T1期癌旁組

7、織相比，共有356個差異表達蛋白，其中172個蛋白上調(diào)表達，193個蛋白下調(diào)表達。而T3期癌組織與T1期癌旁組織相比，共篩選到差異表達蛋白387個，其中185個蛋白表達上調(diào)，202個差異蛋白表達下調(diào)。這些差異蛋白分布在外源物質(zhì)代謝、維生素代謝、細胞凋亡、肝臟脂肪性變、上皮細胞癌、腫瘤細胞增殖、氧化應(yīng)激、細胞擴散與細胞粘附和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等相關(guān)通路，提示這些變化可能與肝癌的發(fā)展高度相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，相比于癌旁組織，F(xiàn)LNC蛋白的表達量在

8、癌組織中顯著上調(diào)，且隨著肝細胞癌疾病病程的發(fā)展其表達量逐漸升高。這一結(jié)果還被Western Blot和TCGA數(shù)據(jù)庫中50例肝癌的癌與癌旁樣本數(shù)據(jù)證實，提示該蛋白可作為肝細胞癌病程發(fā)展過程中的一個新的潛在生物標志物。
　　在上述實驗基礎(chǔ)上，我們選取了具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞系 Hep3B、MHCC-97L、MHCC-97H和HCC-LM6細胞系，利用實驗室新近發(fā)展的基于人工雜種UBD的高效泛素化蛋白純化技術(shù)，結(jié)合翻譯后修飾鑒定的

9、方法探索了腫瘤細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)尤其是泛素蛋白酶體途徑的變化與失調(diào)情況。共鑒定潛在的泛素化蛋白2569個，以Hep3B細胞系作為對照細胞系，97L、97H和LM6細胞與其進行比較，97L/Hep3B組得到差異蛋白200個，其中上調(diào)蛋白109個，下調(diào)蛋白91個；97H/Hep3B組得到差異蛋白215個，其中上調(diào)蛋白109個，下調(diào)蛋白106個；LM6/Hep3B組得到差異蛋白97個，其中上調(diào)蛋白42個，下調(diào)蛋白55個。這些差異蛋白主要

10、集中在細胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合素信號通路、肌動蛋白細胞骨架信號通路、上皮細胞緊密連接重塑、CDC42相關(guān)信號通路、樁蛋白信號通路、RhoGDI信號通路、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的PI3K/AKT信號通路、EIF2信號通路以及ERK/MAPK信號通路、等。這是首次從泛素化修飾水平探索肝癌轉(zhuǎn)移機制的嘗試。
　　綜上所述，本研究依托實驗室成熟的高精度及高覆蓋度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺、翻譯后修飾鑒定技術(shù)平臺，通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)中的iTRAQ技

11、術(shù)和翻譯后修飾鑒定技術(shù)，以不同轉(zhuǎn)移潛能的肝細胞癌患者的組織及細胞系樣本作為模型，進行了深入系統(tǒng)的研究，揭示了肝癌轉(zhuǎn)移過程中細胞分子水平及信號通路等的變化情況，建立了不同轉(zhuǎn)移能力肝癌組織的蛋白質(zhì)表達譜及不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞系的泛素化修飾表達譜。并發(fā)現(xiàn) FLNC蛋白的表達量在癌組織中顯著上調(diào)，且隨著肝細胞癌疾病病程的發(fā)展其表達量逐漸升高，提示該蛋白可能是肝細胞癌病程發(fā)展過程中的一個新的潛在生物標志物。本研究也為肝細胞癌的診斷與治療提供了新