人宮頸鱗狀上皮永生化細胞和癌細胞胞漿及胞膜差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：建立HPV-16陽性的宮頸上皮永生化細胞(H8細胞株)和宮頸癌細胞(Caski細胞株)胞漿和胞膜蛋白雙向電泳圖譜，將二者進行比較，篩選出差異表達蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，為宮頸癌癌變機制和抗癌藥物靶點的選擇提供信息和幫助。 方法： 1、將H8細胞和Caski細胞置于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，待細胞數(shù)約達到3×106時收集細胞，加入亞細胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)提取試劑分別提取胞漿和胞膜蛋白質(zhì)。 2、用雙向凝膠電泳(2

2、-dimensional gel electrophoresis，2-DE)分別分離H8和Caski細胞的胞漿和胞膜蛋白質(zhì)，經(jīng)銀染后用ImageMaster 2D軟件進行圖像分析，尋找出顯著差異蛋白點。 3、對差異表達蛋白斑點用胰酶進行酶切，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)分析酶切片斷，得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF)，使用國際互聯(lián)網(wǎng)上Matrix Science公司提供的PMF鑒定程序進行查詢鑒定。

3、 結(jié)果： 1、通過亞結(jié)構(gòu)蛋白提取方法和雙向電泳技術(shù)獲得了清晰的、分辨率高和重復(fù)性好的H8細胞和Caski細胞胞漿和胞膜蛋白質(zhì)表達的二維凝膠電泳圖譜。 2、通過ImageMaster 2D V2002.1圖像分析軟件分析，對H8細胞和Caski細胞胞漿2-DE圖譜進行膠間的斑點匹配，發(fā)現(xiàn)兩株細胞胞漿蛋白質(zhì)凝膠圖像蛋白斑點主要集中在PI為4～8和分子量為10～180KD，H8細胞胞漿蛋白斑點總數(shù)約為1123個，Caski

4、細胞胞漿蛋白斑點總數(shù)約為1231個，匹配率為70％。比較兩個圖譜發(fā)現(xiàn)有8個蛋白點的在胞漿表達中存在明顯的差異。而在兩株細胞胞膜蛋白質(zhì)凝膠圖像中蛋白斑點主要集中在PI為4～9和分子量為10～200KD，H8細胞胞膜蛋白斑點總數(shù)約為1107個，Caski細胞胞膜蛋白斑點總數(shù)約為1033個，匹配率為71％。比較兩個圖譜發(fā)現(xiàn)有13個蛋白點的在胞膜表達中存在差異。 3、對H8細胞和Caski細胞的胞漿蛋白2-DE圖譜進行比較，找到8個顯著

5、差異表達的蛋白質(zhì)斑點，對其進行質(zhì)譜分析，初步鑒定出6種差異蛋白質(zhì)，它們分別是：S 100P、Ikkb(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit)、CDK6(Cell division protein kinase 6)、TAF2(Transcription initiation factor TFIID subunit 2)、 STK3(Serine/threonine-pro

6、tein kinase 3)、TRAF5(TNF receptor-associatedfactor 5)。其中STK3、TRAF5在宮頸癌細胞株胞漿中蛋白質(zhì)表達缺失，S100P、Ikkb、CDK6、TAF2在宮頸癌細胞株胞漿中蛋白質(zhì)表達上調(diào)。 4、對H8細胞和Caski細胞的胞膜蛋白2-DE圖譜進行比較，篩選出13個差異表達的蛋白質(zhì)斑點，對其進行質(zhì)譜分析，初步鑒定出3種差異蛋白質(zhì)，它們分別是：LRC8D(Leucine-ric

7、h repeat-containingprotein 8D)、EDAR(Tumor necrosis factor receptor superfamily memberEDAR precursor)、Metaxin-1，它們均在宮頸鱗狀上皮永生化細胞株胞膜中蛋白質(zhì)表達上調(diào)。 結(jié)論：在宮頸癌前病變到癌變過程中基因和其相應(yīng)的蛋白質(zhì)發(fā)生了很大的變化，對人宮頸鱗狀上皮永生化細胞(H8)和宮頸癌細胞(Caski)2-DE圖譜進行比較，篩

8、選鑒定出了6種差異胞漿蛋白和3種差異胞膜蛋白，其中S100P，IKKb，CDK6，TAF2這4種蛋白質(zhì)在宮頸癌細胞胞漿中高表達，可能是通過在細胞增值、分化、抑制細胞凋亡、加快細胞周期造成細胞周期調(diào)節(jié)失控和細胞異常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。而STK3,TRAF5蛋白質(zhì)在宮頸癌細胞胞漿中表達缺失和LRC8D，EDAR，Metaxin-1在宮頸鱗狀上皮永生化細胞胞膜中高表達可能與它們促進細胞凋亡過程及抑制細胞異常增殖等密切相關(guān)，從而抑制腫瘤形