牙鲆（Paralichthys olivaceus）外周血單個(gè)核細(xì)胞的離體培養(yǎng)和細(xì)胞學(xué)研究.pdf

1、牙鲆(Paralichthys olivaceus)肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)北方沿海地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)魚(yú)類之一。但隨著近年來(lái)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，牙鲆腹水病、病毒性神經(jīng)壞死癥等各種病害的爆發(fā)和流行給生產(chǎn)企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于對(duì)牙鲆免疫機(jī)理和機(jī)制的了解較少，尚無(wú)有效的免疫防治技術(shù)和方法，仍然采用化學(xué)藥物和抗生素等傳統(tǒng)的方式來(lái)控制病害的發(fā)生。但長(zhǎng)期使用抗生素使病菌的抗藥性越來(lái)越強(qiáng)，并且大量的藥物殘留嚴(yán)

2、重破壞了生態(tài)環(huán)境,食用魚(yú)的安全性也受到了影響。外周血單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是魚(yú)類體液免疫的重要組成部分，在魚(yú)類特異性免疫和非特異性免疫過(guò)程中起著重要作用。目前對(duì)于牙鲆單個(gè)核細(xì)胞的免疫功能研究尚屬起步階段，尚不清楚其作用機(jī)制。本研究以養(yǎng)殖牙鲆為材料，對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)和細(xì)胞學(xué)觀察，同時(shí)對(duì)單個(gè)核細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞膜表達(dá)離子通道的電生理特征進(jìn)行了觀察。為建立牙鲆血細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)和探究細(xì)胞免疫功能奠定基礎(chǔ)。

3、通過(guò)對(duì)牙鲆外周血細(xì)胞的分離鑒定，確定單個(gè)核細(xì)胞的形態(tài)特征,用密度梯度離心的方法，分離出純凈的單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞，分析不同因素對(duì)細(xì)胞離體存活和生長(zhǎng)的影響，優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，建立離體細(xì)胞培養(yǎng)方法。并對(duì)離體培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌吞噬實(shí)驗(yàn)和膜表達(dá)離子通道研究，主要研究結(jié)果和結(jié)論如下： 1.通過(guò)對(duì)牙鲆外周血進(jìn)行染色，可在光鏡下鑒別出紅細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和嗜堿性粒細(xì)胞7種細(xì)胞。利用

4、細(xì)胞分層液(比重為1.083)，20℃，水平離心3000r／min，15min，Hank's溶液洗滌，可得純凈的單個(gè)核細(xì)胞。 2.離體培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞在含20％胎牛血清、終濃度100U／ml青霉素和鏈霉素、終濃度為O．5mmol／L谷氨酰胺、添加PHA(30μg／ml)的M199培養(yǎng)液中，于25℃，24孔培養(yǎng)皿(Costar，美國(guó))中能夠貼壁生長(zhǎng)傳至6代，存活30天以上。貼壁生長(zhǎng)的單核細(xì)胞形狀不規(guī)則，長(zhǎng)徑11.05±0.91μm

5、，短徑9.55±1.39 μm；淋巴細(xì)胞近似呈圓形，長(zhǎng)徑7.31±1.05μ m，短徑6.13±0.97μm。均呈鵝卵石狀緊密排列，并有接觸性抑制現(xiàn)象，長(zhǎng)滿單層時(shí)細(xì)胞會(huì)脫壁懸浮。 3.將離體培養(yǎng)傳至第二代(7d)的單個(gè)核細(xì)胞用于金黃色葡萄球菌吞噬實(shí)驗(yàn)。單核細(xì)胞在發(fā)生吞噬時(shí)，細(xì)胞常通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)把細(xì)菌包裹至細(xì)胞內(nèi)，吞噬率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)分別為(61.9±3.05)％和1.58±0.51。淋巴細(xì)胞常見(jiàn)到細(xì)菌粘到細(xì)胞表面，吞