牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6基因和TAK1基因的克隆及免疫應(yīng)答研究.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）為冷溫性底棲魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，隨著高密度集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，魚(yú)類(lèi)疾病的傳染也日益嚴(yán)重，養(yǎng)殖場(chǎng)中魚(yú)類(lèi)大規(guī)模的死亡及其造成的重大經(jīng)濟(jì)損失給人工養(yǎng)殖提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，深入研究牙鲆的抗病免疫機(jī)制，探尋增強(qiáng)養(yǎng)殖品種免疫力的途徑和方法，培育牙鲆抗病新品系，對(duì)于牙鲆養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大十分重要。
　　Toll樣受體(TLRs)可識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，是模式識(shí)別受

2、體（PRRs）家族中的成員，在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。TLRs識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的配體后，可激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的分泌和共刺激分子的表達(dá)，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。TRAF6和TAK1是Toll樣受體信號(hào)通路中兩個(gè)重要的接頭蛋白，可激活下游信號(hào)通路，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答反應(yīng)和特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究克隆到了TRAF6基因和TAK1基因的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其蛋白序列、調(diào)控區(qū)域及表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步研究這

3、兩個(gè)基因在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理提供了理論依據(jù)。
　　牙鲆TRAF6基因cDNA全長(zhǎng)1953 bp，包括1713 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），159 bp的5'UTR和81 bp的3'UTR，預(yù)測(cè)該基因編碼570個(gè)氨基酸。利用在線軟件分析了牙鲆TRAF6基因的蛋白結(jié)構(gòu)域，包括N端的RING結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，一個(gè)環(huán)-環(huán)(coiled-coil)α螺旋結(jié)構(gòu)域以及高度保守的MATH結(jié)構(gòu)域。牙鲆TRAF6與巨石斑魚(yú)TRAF6的一致性高

4、達(dá)91％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，牙鲆TRAF6和半滑舌鰨TRAF6聚為一支，親緣關(guān)系最近。對(duì)其調(diào)控區(qū)進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，多為參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)示了他們?cè)诿庖邞?yīng)答反應(yīng)中的潛在功能。熒光定量PCR結(jié)果顯示牙鲆TRAF6基因廣泛的表達(dá)于各組織中，但其表達(dá)量存在顯著的差異，在腸和心臟中有較高的表達(dá)。TRAF6在腸等免疫器官中的高表達(dá)，與其在Toll樣受體信號(hào)通路中的重要作用是一致的。對(duì)牙鲆早期胚胎

5、發(fā)育不同時(shí)期TRAF6基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，TRAF6基因在所有時(shí)期都有表達(dá)，包括未受精卵，提示了TRAF6基因的母源性表達(dá)。免疫分子母源性mRNA的存在可能參與發(fā)育過(guò)程，也可能參與構(gòu)建免疫體系，以保護(hù)胚胎或仔魚(yú)免受病原體的侵襲。免疫刺激實(shí)驗(yàn)表明，LPS、poly I∶C和CpG ODN都可以上調(diào)TRAF6基因的表達(dá)。
　　牙鲆TAK1基因cDNA全長(zhǎng)2086 bp，其中包括ORF1728 bp，5'UTR232 bp

6、，3'UTR128 bp，根據(jù)其完整的ORF預(yù)測(cè)TAK1基因編碼575個(gè)氨基酸殘基的蛋白。牙鲆TAK1基因與其他物種的一致性很高，與點(diǎn)帶石斑魚(yú)的一致性高達(dá)97％。牙鲆TAK1蛋白包括一個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活結(jié)構(gòu)域以及羧基端的環(huán)-環(huán)(coiled-coil)α螺旋結(jié)構(gòu)域。對(duì)其調(diào)控區(qū)進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，多為參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)示了他們?cè)诿庖邞?yīng)答反應(yīng)中的潛在功

7、能。熒光定量PCR結(jié)果顯示牙鲆TAK1基因在所檢測(cè)的所有組織中都有表達(dá)，但其表達(dá)量存在明顯的差異，在腸和心臟中有較高的表達(dá)。對(duì)牙鲆早期胚胎發(fā)育不同時(shí)期TAK1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，TAK1基因在所有時(shí)期都有表達(dá)，包括未受精卵，提示了TAK1基因的母源性表達(dá)。免疫分子母源性mRNA的存在可能參與發(fā)育過(guò)程，也可能參與構(gòu)建免疫體系，以保護(hù)胚胎或仔魚(yú)免受病原體的侵襲。免疫刺激實(shí)驗(yàn)表明，LPS、poly I∶C和CpG ODN都可以上