30211.牙鲆免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析

1、中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文牙鲆免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析姓名：李朔申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：海洋生物學(xué)指導(dǎo)教師：張全啟200906012牙鲆免疫相關(guān)基因l(Polivaceusimmunerelatedgene1，PolRl)的克隆及分析通過DDPCR和RACE技術(shù)，拼接得到了長度為997bp的牙鲆免疫相關(guān)基因l(EU224373)全長cDNA，其中5’UTR為523bp，ORF為300bp，3’UTR為174bp，可編碼99個(gè)氨基酸，預(yù)

2、測(cè)的分子量約為1046KD，等電點(diǎn)為814?；蚪MDNA序列共含有2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)外顯子。編碼的蛋白含有一個(gè)19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，為分泌型蛋白。通過結(jié)構(gòu)功能域的查找，發(fā)現(xiàn)此蛋白一個(gè)原核生物膜脂蛋白的附著點(diǎn)。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)后并沒有發(fā)現(xiàn)與之相似的序列，因此給此基因命名為牙鲆免疫相關(guān)基因1(Polivaceusimmunerelatedgene1，PolRl)。半定量RTPCR結(jié)果表明，對(duì)照組中，在所有的組織器官(肝臟、腎臟、脾臟、

3、鰓、小腸、心臟、肌肉)中均未檢測(cè)到PolRl的表達(dá)。鰻弧菌注射后，在所有的組織中均檢測(cè)到了PolRl的表達(dá)，且隨著時(shí)間的延長，表達(dá)量有明顯上升的趨勢(shì)。推測(cè)該基因的編碼產(chǎn)物可能是抗菌肽類似的小分子直接參與消滅病原生物或者作為信號(hào)分子通過與病原生物的膜結(jié)合識(shí)別出外界的入侵從而引起機(jī)體內(nèi)部的級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)。以pET32a為表達(dá)質(zhì)粒，將PolRl的成熟肽基因序列插入其中構(gòu)建了pET32aPolRl重組質(zhì)粒，并在BL21(DE3)pLysS中進(jìn)行融

4、合表達(dá)。SDSPAGE蛋白電泳和WesternBlot分析發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在相對(duì)分子量29kDa處出現(xiàn)一條特異條帶，正好是標(biāo)簽蛋白TrxTag相對(duì)分子質(zhì)量(20kDa)與PolR2的成熟肽相對(duì)分子質(zhì)量(9kDa)的總和，與預(yù)期融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符，表明成功構(gòu)建了TrxPolRl融合蛋白重組原核表達(dá)系統(tǒng)，且大部分以可溶性蛋白形式存在，為進(jìn)一步從分子水平探討新基因PolRI成熟肽的研究奠定了基礎(chǔ)。3牙鲆免疫相關(guān)基因2(Polivaceusi

5、mmulaerelatedgene2，PolR2)的克隆及分析通過DDPCR和RACE技術(shù)，拼接得到了長度為1061bp的牙鲆免疫相關(guān)基因2(EU224372)全長cDNA，其中5’UTR為169bp，ORF為336bp，3UTR為556bp，可編碼1l1個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量約為1384KD，等電點(diǎn)為8Ol?；蚪MDNA序列共含有5個(gè)內(nèi)含子，6個(gè)外顯子。編碼的蛋白含有一個(gè)26個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，為分泌型蛋白。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)后并