牙鲆HSP70與HSC70基因的克隆、表達(dá)及其SNPs與耐熱性狀的相關(guān)性分析.pdf

1、牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類,其肉質(zhì)細(xì)嫩,味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。我國(guó)的牙鲆增產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始得到了迅猛發(fā)展。然而,牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也帶來(lái)了諸多不容忽視的問(wèn)題,隨著工廠化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化、以及牙鲆的高繁殖能力使得國(guó)內(nèi)大部分養(yǎng)殖基地親本繁育群體過(guò)小和更換率過(guò)低,導(dǎo)致牙鲆養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的降低,使得現(xiàn)在養(yǎng)殖的牙鲆出現(xiàn)疾病爆發(fā)頻繁、死亡嚴(yán)重、養(yǎng)殖效益大幅下

2、降的情況。因此急需培育生長(zhǎng)速度快,抗病能力高、抗逆性強(qiáng)的牙鲆新品種來(lái)滿足當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)的迫切需要,為此做了以下工作:
　　 1.牙鲆的選育效果評(píng)估
　　 為了評(píng)估牙鲆(Paralhzhthys olivaceus)人工選育的育種效果,以2007年經(jīng)過(guò)家系選育的具有優(yōu)良生長(zhǎng)性狀的第一代個(gè)體為親本,依據(jù)巢式交配設(shè)計(jì),構(gòu)建了第二代10個(gè)半同胞家系和20個(gè)全同胞家系。在養(yǎng)殖4個(gè)月后進(jìn)行生長(zhǎng)性狀的測(cè)定,對(duì)比測(cè)試結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)選育的群體

3、的平均體質(zhì)量比未經(jīng)選育的對(duì)照組提高了2.91克,遺傳增益為11.25％,顯著高于未經(jīng)選育的群體；經(jīng)過(guò)選育的群體全長(zhǎng)極顯著顯著高于未經(jīng)選育的群體,全長(zhǎng)的遺傳增益較未選育的群體提高了1.33厘米,遺傳增益為10.36％。初步達(dá)到了改良生長(zhǎng)性狀的效果。體重、全長(zhǎng)和體高的遺傳力為分別為0.656～0.731,0.481～0.742,0.480～0.651,均屬于高等遺傳力,顯示牙鲆選擇育種仍舊可以取得較快的遺傳進(jìn)展,具有較大的選擇潛力。

4、　　 2.Hsp70與Hsc70基因的克隆及表達(dá)分析
　　 Hsp70是熱休克反應(yīng)(heat shock reaction,HSR)中生成最為顯著、最主要的一種應(yīng)激蛋白。它能通過(guò)分子伴侶作用與蛋白分子結(jié)合,保護(hù)新合成蛋白分子的正確構(gòu)型并參與蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和組裝；當(dāng)?shù)鞍资軗p變性時(shí),能促使其恢復(fù),或加速其降解與清除；能重新激活某些酶,以維護(hù)細(xì)胞的功能和生存。研究表明,Hsc70屬于結(jié)構(gòu)型蛋白主要存在于正常細(xì)胞,而Hsp70

5、僅出現(xiàn)在應(yīng)激細(xì)胞,且在細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)增加明顯。
　　 本研究克隆獲得了牙鲆熱休克蛋白Hsp70及其同源蛋白Hsc70的基因cDNA和DNA全長(zhǎng),并對(duì)二者在熱激條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。
　　 Hsp70的cDNA總長(zhǎng)為2006bp,包括5’UTR109bp,3’UTR160bp以及編碼區(qū)1923bp,可編碼640個(gè)氨基酸。DNA總長(zhǎng)2646bp,其中編碼區(qū)內(nèi)無(wú)內(nèi)含子,位于編碼區(qū)5端外側(cè)含有一個(gè)符合GT-AG規(guī)則的長(zhǎng)45

6、4bp的內(nèi)含子。Hsc70的cDNA總長(zhǎng)為2068bp,包括5’UTR60bp,3’UTR31bp以及編碼區(qū)1953bp,其ORF編碼650個(gè)氨基酸。Hsc70基因DNA全長(zhǎng)3046bp,序列包括8個(gè)外顯子,7個(gè)內(nèi)含子。
　　 方差分析表明,在牙鲆的心肌細(xì)胞中,正常條件下(0h),Hsp70幾乎不表達(dá),當(dāng)瞬時(shí)的熱激處理后,hsp70開(kāi)始大量表達(dá),并隨著熱脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸降低,到達(dá)8小時(shí)的時(shí)候幾乎不表達(dá)。
　　 在

7、未經(jīng)熱處理的對(duì)照組中(0h),Hsc70大量表達(dá)。在熱休克開(kāi)始之后,其表達(dá)很快受到抑制,表達(dá)量幾乎為0,在此后的8個(gè)小時(shí)內(nèi)幾乎都沒(méi)有表達(dá)的情況發(fā)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)具有耐熱表現(xiàn)型差異的家系之間Hsp70的表達(dá)情況沒(méi)有差異,Hsp70的表達(dá)情況與家系之間也沒(méi)有交互作用發(fā)生。
　　 3.HSP70的SNP位點(diǎn)與牙鲆耐熱性狀的關(guān)聯(lián)分析
　　 擴(kuò)增并測(cè)序了60條篩選出來(lái)的具有耐熱性狀差異的牙鲆群體Hsp70基因(相對(duì)耐熱與不耐熱牙鲆