魔芋耐熱性鑒定及熱激蛋白HSP基因的克隆與初步分析.pdf

1、魔芋（Amorphophallus rivieri）喜溫不耐熱，高溫是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要非生物脅迫因素之一。在我國(guó)西南主要魔芋種植區(qū)域，特別是川渝芋區(qū)，周期性的熱害常有發(fā)生，因此，篩選耐熱種質(zhì)資源、選育耐熱新品種尤為重要。種質(zhì)材料的耐熱性鑒定是魔芋耐熱育種的基礎(chǔ)，然而目前我們對(duì)魔芋耐熱的生理機(jī)制、分子機(jī)制及互作調(diào)控機(jī)理的細(xì)節(jié)知之甚少。本研究根據(jù)前人對(duì)魔芋田間農(nóng)藝性狀的觀察結(jié)果，選取耐熱性差異明顯的3個(gè)魔芋種為實(shí)驗(yàn)材料，分別從生理生化

2、和分子生物學(xué)兩方面研究了魔芋耐熱的生理基礎(chǔ)與調(diào)控機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究魔芋耐熱因子表達(dá)調(diào)控和功能分析奠定基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)以耐熱性明顯不同的白魔芋（Amorphophallus albus，Aa）、花魔芋（Amorphophallus konjac，Ak）和珠芽魔芋（Amorphophallus bulbifer，Ab）為試材。通過(guò)測(cè)定43℃高溫脅迫下葉片生理生化指標(biāo)含量的變化、觀察葉片微觀組織結(jié)構(gòu)以及統(tǒng)計(jì)熱害指數(shù)的變化，掌握了高

3、溫脅迫下3種魔芋試材主要耐熱指標(biāo)的變化規(guī)律，明確了不同魔芋種耐熱性強(qiáng)弱以及篩選能有效反映魔芋耐熱性差異的指標(biāo)，探討了魔芋耐熱的生理機(jī)制；利用已經(jīng)公開的耐熱相關(guān)熱激蛋白基因同源序列設(shè)計(jì)引物，克隆了3種魔芋材料熱激蛋白基因sHSP、HSP70和HSP90，并根據(jù)已測(cè)序序列設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物，研究了不同時(shí)間高溫脅迫下sHSP、HSP70和HSP90在魔芋葉片中的表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下：
　　1．魔芋的耐熱性鑒定
　　利

4、用耐熱性差異明顯不同的白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋試材，測(cè)定了43℃高溫脅迫下不同魔芋葉片相關(guān)耐熱指標(biāo)。結(jié)果表明，高溫處理后，Aa葉片中CAT活性、SP和Pro含量的大小和增幅均大于Ak和Ab，Ab居中，Ak最??；Ak葉片中REC和MDA含量的大小和增幅最高，Ab居中，Aa最小；高溫處理6h、18h和24h，Aa葉片中SOD和APX活性及增幅均顯著大于Ab和Ak；高溫處理6h后，Aa葉片中SS含量及增幅顯著高于Ab和Ak。同時(shí)高溫脅迫過(guò)程中

5、，Aa葉片中Pn、Tr、Chl a/b的大小和降幅均大于Ab和Ak，處理1d、2d和4d的葉片中Gs和Ci大小依次是Aa、Ab和Ak。供試材料在高溫脅迫過(guò)程中，Aa葉片的氣孔密度和開度大于Ab和Ak，其葉肉細(xì)胞受到高溫脅迫的影響和損傷也最低，處理4d后，熱害指數(shù)差異顯著，Aa最低，其次是Ab和Ak。表明CAT、SP、Pro、REC、MDA、Chl a/b、Pn、Tr、微觀組織結(jié)構(gòu)和熱害指數(shù)十個(gè)耐熱指標(biāo)的變化規(guī)律能夠準(zhǔn)確反映魔芋耐熱性差異

6、，可用于耐熱性鑒定，3種供試材料的耐熱性強(qiáng)弱依次是白魔芋Aa、珠芽魔芋Ab和花魔芋Ak。POD活性指標(biāo)在高溫脅迫下變化復(fù)雜，與各種間耐熱性無(wú)顯著相關(guān)。
　　2．魔芋HSP基因的克隆與序列分析
　　以白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋為試材，通過(guò)同源克隆法獲得AasHSP、AksHSP和AbsHSP基因片段大小均為468bp，包含全長(zhǎng)開放閱讀框，編碼155個(gè)氨基酸殘基。生物信息學(xué)方法分析表明，蛋白分子量分別為17.284、17.270和

7、17.095kDa；等電點(diǎn)為6.84、6.84和6.31；氨基酸序列C端均含有典型的ACD保守結(jié)構(gòu)域；與半夏PtsHSP的親緣關(guān)系最近。同源克隆法獲得AaHSP70、AkHSP70和AbHSP70基因片段大小分別為1944bp、1947bp和1944bp，包含全長(zhǎng)開放閱讀框，各自編碼647、648、647個(gè)氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析表明，蛋白分子量分別為71.069、71.054和71.023kDa；等電點(diǎn)為5.14、5.16和5.17

8、；氨基酸序列N端均含有高度保守的NBD結(jié)構(gòu)域；與芭蕉MaHSP70和棉花GrHSP70親緣關(guān)系最近。同源克隆法獲得AaHSP90、AkHSP90和AbHSP90基因片段大小均為2103bp，包含全長(zhǎng)開放閱讀框，編碼700個(gè)氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析表明，蛋白分子量分別為80.036、80.056和80.188kDa；等電點(diǎn)為5.01、5.01和5.00；氨基酸序列N端均含有ATPase保守結(jié)構(gòu)域；與芭蕉MaHSP90親緣關(guān)系最近。

9、>　　3．高溫脅迫下HSP基因的半定量RT-PCR分析
　　以白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋為試材，利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了不同基因在高溫脅迫不同時(shí)間下葉片表達(dá)情況。結(jié)果顯示，感熱種花魔芋AksHSP在熱激0.5h后表達(dá)量迅速增加到最高值，而耐熱種白魔芋AasHSP和珠芽魔芋AbsHSP基因熱激響應(yīng)時(shí)間較AksHSP長(zhǎng)，在2h后達(dá)峰值，且AasHSP基因的表達(dá)峰值及表達(dá)總量均明顯高于AksHSP和AbsHSP。感熱種花魔芋AkH

10、SP70在熱激0.5h后表達(dá)量迅速增加到最高值，而白魔芋AaHSP70和珠芽魔芋AbHSP70基因熱激響應(yīng)時(shí)間較AkHSP70長(zhǎng)，分別在2h和5h后達(dá)峰值，且AaHSP70基因的表達(dá)量明顯高于其余二者。感熱種花魔芋AkHSP90在熱激0.5h后表達(dá)量迅速增加到最高值，而耐熱性更強(qiáng)的白魔芋AaHSP90和珠芽魔芋AbHSP90基因熱激響應(yīng)時(shí)間較AkHS90P長(zhǎng)，分別在2h和1h后達(dá)峰值，且AaHSP90基因的的表達(dá)峰值及表達(dá)總量均明顯高于