大豆熱激蛋白90(Hsp90)家族基因的克隆及功能初步研究.pdf

1、大豆[Glycine max(L.) Merr.]是一種重要的農作物和經濟作物，它對于改善人類食物結構，滿足人類對植物蛋白和油脂的需求都具有重要的作用。然而在大豆生長和發(fā)育過程中經常會遭受高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫的影響，造成產量的損失和品質變化，從而導致嚴重的經濟損失，因此對大豆應答非生物脅迫的不同機制以及他們后天獲得的脅迫抗性進行研究具有重要的意義。逆境脅迫會導致生物體蛋白不正常的折疊，從而引起細胞產生多種問題，因此所有物種都具有

2、專一的蛋白組裝系統(tǒng)用以維持蛋白的平衡以及減輕脅迫造成的傷害。這個系統(tǒng)的指令中心就是分子伴侶和蛋白重塑因子。這類蛋白中很多都會受到熱激的上調表達，因此這些能夠受到熱激上調表達的蛋白被稱為熱激蛋白(Heat shock protein，Hsp)，而Hsp90被認為是這個蛋白系統(tǒng)平衡的中心。近年來很多植物的Hsp90都已被發(fā)現(xiàn)會受到逆境脅迫的的誘導表達，但是深入的研究并不多見。本論文主要針對大豆GmHsp90在非生物脅迫下的相關功能進行了研究

3、，主要結果如下:
　　1.通過同源比對，發(fā)現(xiàn)大豆基因組中含有12個完整的Hsp90同源序列，并將其從大豆耐旱品種Y7F9002中全部分離。初步的生物信息分析結果表明，這12個基因分布于不同的大豆染色體上，開放閱讀框(ORF)大小為2097-2447bp，蛋白分子量為80.13-93.56kDa。多重序列比對結果顯示12個GmHsp90蛋白具有高度的保守性，與其他物種的Hsp90相同，近N端區(qū)域都含有Hsp90家族的特征元件‘Y-x

4、-[NQHD]-[KHR]-[DE]-[IVA]F-[LM]R-[ED]'和ATP結合域?；诖蠖笹mHsp90序列的高度保守性以及目前對Hsp90系統(tǒng)命名的原則將這12個GmHsp90分為4個亞家族，分別命名為GmHsp90A1-A6，GmHsp90B1-B2，GmHsp90C1.1，C1.2，GmHsp90C2.1，2.2，以便于下一步的研究。
　　2.利用實時熒光定量PCR對這12個GmHsp90基因在大豆不同組織中的表達特

5、性進行檢測。結果表明，GmHsp90在大豆的根，莖，葉，花和莢中都有表達，但表達豐度各異，其中系統(tǒng)發(fā)育分析結果中來源于同一分支的GmHsp90具有類似的表達模式。利用實時熒光定量PCR對大豆GmHsp90基因在不同的逆境脅迫下的表達模式進行研究，結果表明GmHsp90能夠迅速和劇烈的響應熱激脅迫，特別是GmHsp90A1和GmHsp90A2。這些基因對滲透脅迫和鹽脅迫也都具有應答，但是響應速度和劇烈程度要遠低于對熱激脅迫。而對這12個基

6、因進行低溫脅迫處理后發(fā)現(xiàn)他們對短期的低溫脅迫并沒有強烈的應答。從逆境脅迫表達模式研究結果中發(fā)現(xiàn)雖然GmHsp90As、GmHsp90Bs、GmHsp90C1s和GmHsp90C2s對熱、鹽和滲透脅迫都有應答，但是它們的表達模式具有明顯的差異。此外，雖然歸類于GmHsp90As但是GmHsp90A1和GmHsp90A2的表達模式也明顯與其余GmHsp90A基因有差異，因此本研究進一步將12個GmHsp90分成5種不同的類型。
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7、.通過對大豆12個GmHsp90基因進行初步研究后，從中選擇了5個具有代表性的大豆GmHsp90（GmHsp90A2，GmHsp90A4，GmHsp90B1，GmHsp90C1.1和GmHsp90C21.1）進行模式植物擬南芥的轉化，通過研究轉基因擬南芥在非生物脅迫下的表現(xiàn)對GmHsp90基因功能進行進一步的研究。對轉基因擬南芥種子進行高溫，鹽和滲透脅迫處理后發(fā)現(xiàn)除了GmHsp90B1轉基因株系，過表達GmHsp90的擬南芥種子的萌發(fā)率

8、顯著高于對照植株。對生長3周的轉基因擬南芥植株進行了高溫，鹽和滲透脅迫處理后發(fā)現(xiàn)轉GmHsp90擬南芥的在脅迫下鮮重的下降程度顯著低于對照植株。在持續(xù)高溫脅迫后對轉基因擬南芥植株的敗育程度進行統(tǒng)計，結果表明轉基因植株的敗育率顯著低于對照植株。這些結果說明過表達GmHsp90基因可以降低非生物脅迫對擬南芥的傷害并且在一定程度上維持擬南芥的生長和發(fā)育。進一步測定轉基因擬南芥的葉綠素和MDA含量等生理指標，結果表明過表達GmHsp90基因可以

9、防止植物體內葉綠素的損失和降低MDA的含量，由于這兩個生理指標與非生物脅迫過程中產生氧化脅迫密切相關，我們認為GmHsp90基因，特別是GmHsp90A基因，在非生物脅迫下參與了降低氧化脅迫傷害的過程，以維持轉基因擬南芥的生長和發(fā)育。對轉基因擬南芥體內脯氨酸含量檢測的過程中發(fā)現(xiàn)在正常條件下GmHsp90A和GmHsp90C1的轉基因植株中脯氨酸的積累發(fā)生了異常，而這種脯氨酸的異常積累可能是由于過表達GmHsp90基因擾亂了脯氨酸和P5C

10、S之間的反饋抑制平衡系統(tǒng)所導致的。同樣，對轉基因擬南芥進行鈣離子脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，轉基因擬南芥對鈣離子的脅迫也具有一定的抗性。而這種抗性產生的原因，可能是過表達GmHsp90基因降低了轉基因擬南芥體內O2-等氧化脅迫相關物質，從而一定程度上阻止鈣離子和ROS之間互作而產生的嚴重的氧化脅迫。
　　4.選擇轉基因擬南芥研究結果中抗性較好的GmHsp90A2進行大豆的遺傳轉化研究。經過農桿菌介導的大豆整體轉化法使得GmHsp90A2在大豆

11、品種Y7F9001過表達，最終得到多個陽性植株。利用實時熒光定量PCR對這些轉基因株系中GmHsp90A2的表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，部分株系中GmHsp90A2的表達受到了抑制，對這些株系在逆境脅迫下的葉綠素含量，MDA含量和O2-含量測定發(fā)現(xiàn)，這些株系受到更嚴重的氧化脅迫的傷害，對逆境脅迫的抗性也隨之降低。該結果進一步說明GmHsp90A2在降低逆境脅迫下氧化脅迫對植物的傷害中確實起著重要的作用。
　　5.鑒于GmHsp90A2對非生

12、物脅迫強烈的應答效果，對其啟動子進行了克隆研究。從GmHsp90A2的5'非翻譯區(qū)上游分離了一段3，913bp的序列。通過將該啟動子區(qū)域與GUS基因連接，構建瞬時表達載體并侵染洋蔥表皮細胞和擬南芥。GUS組織化學染色結果表明，該序列具有啟動子的活性并且能夠通過轉基因方式在植物體內行使功能，使得GUS基因在植物體內穩(wěn)定地表達。對侵染后的洋蔥表皮細胞進行熱激處理并進行GUS染色后發(fā)現(xiàn)，GmHsp90A2啟動子能夠受到熱激脅迫的強烈誘導。初步