小鼠Hsp70基因序列分析及其在囊胚內(nèi)表達(dá)的研究.pdf

1、以TRIzol法提取40℃熱應(yīng)激1h小鼠肝臟總RNA，根據(jù)Genbank中小鼠Hsp70 eDNA序列設(shè)計引物，采用RT-PCR方法克隆了昆明小鼠Hsp70 cDNA全長序列并對其進(jìn)行序列和分子進(jìn)化分析。同時將體外培養(yǎng)至囊胚的小鼠胚胎分為7組，每組50枚。其中，40℃熱應(yīng)激3組，38℃熱應(yīng)激3組，分別應(yīng)激1h，2h，3h，然后在37℃條件下分別恢復(fù)3h，2h，1h；對照1組，37℃培養(yǎng)4h，每組進(jìn)行三個重復(fù)，然后提取胚胎細(xì)胞內(nèi)總RNA，

2、根據(jù)所測序列和Genbank發(fā)表序列設(shè)計引物，18S rRNA引物作為內(nèi)參，采用半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR方法檢測熱應(yīng)激小鼠囊胚內(nèi)Hsp70 mRNA的表達(dá)水平。試驗結(jié)果如下： 1.采用RT-PCR方法成功克隆了1926bp的Hsp70 cDNA全長序列，與Genbank已發(fā)表序列經(jīng)BLAST分析同源性為99.3％，共有13個位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致氨基酸殘基7處發(fā)生替換，氨基酸列同源性為98.8％，但是蛋白質(zhì)等電點(diǎn)

3、無變化，為5.516。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示，α-螺旋占39％，β-折疊占10％，Tum(轉(zhuǎn)角)占6％，Coil(無規(guī)則卷曲)占45％。 2.采用DNAStar protean軟件對小鼠Hsp70與其他各動物物種Hsp70進(jìn)行分子進(jìn)化分析顯示，小鼠Hsp70與大鼠Hsp70-1A，Hsp70-1B，Hsp70，牛Hsp70-1A，Hsp70-1B，人Hsp70-1A，Hsp70-1B，狗Hsp70同源性較高，與其他物種同源性相對較

4、低，與山羊Hsp70同源性僅為81.1％。 3.采用18S rRNA做內(nèi)參對小鼠熱應(yīng)激囊胚內(nèi)Hsp70 mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量分析顯示，各試驗組，包括對照組都有Hsp70基因的表達(dá)，其中，38℃熱應(yīng)激組的小鼠囊胚在熱應(yīng)激開始1h后，細(xì)胞內(nèi)Hsp70 mRNA水平無明顯變化，熱應(yīng)激2h后Hsp70 mRNA達(dá)到較高水平，之后下降；40℃熱應(yīng)激組在熱應(yīng)激開始1h后小鼠囊胚細(xì)胞內(nèi)Hsp70 mRNA就達(dá)到較高水平，為對照組的5.89

5、3倍，之后隨熱應(yīng)激時間延長而下降。 4.以18S rRNA做外標(biāo)，用實時熒光定量RT-PCR定量分析了小鼠囊胚細(xì)胞內(nèi)Hsp70 mRNA的變化水平，結(jié)果顯示，38℃1h熱應(yīng)激組的Hsp70 mRNA較對照組略有增加，僅增加4.59倍，熱應(yīng)激2 h后達(dá)到較高水平，是對照組的137.19倍，然后開始迅速下降，熱應(yīng)激3h后，下降到對照組的29.86倍。40℃熱應(yīng)激1 h后，胚胎細(xì)胞內(nèi)Hsp70 mRNA是對照組的103.97倍，然后隨