羅非魚感染鏈球菌后hsp70基因表達研究

1、廣西農(nóng)業(yè)科學2010，41(4)：371374Gu鋤g】【iAgriculturalSciences37l羅非魚感染鏈球菌后hsp70基因表達研究王瑞t一，黃艷華1，陳明2，梁萬文z，黃鈞1’(1廣西大學動物科學技術學院，南寧530005；2廣西水產(chǎn)研究所，南寧530021)摘要：采用實時熒光定鼉RT—PCR檢測吉富羅非魚感染鏈球菌后腦和脾臟中熱休克蛋白70(hsp70)基因表達情況，并按2一AAC吩析方法、使用7500Software

2、v201進行分析。結(jié)果表明，羅非魚感染鏈球菌48h內(nèi)，hsp70mRNA在腦組織表達變化不明顯，而在脾臟中表達升高，攻毒感染24h后hsp70mRNA表達量是正常脾臟組織的55倍多，說明hsp70在羅非魚鏈球菌感染的免疫反應中具有重要作用。研究結(jié)果為進一步分析hsp70在羅非魚感染鏈球菌過程中所行使的功能奠定基礎。關鍵詞：羅非魚；hsp70基因；鏈球菌；實時熒光定量RTPCR；基因表達中圖分類號：S965125文獻標識碼：A文章編號：1

3、002—8161(2010)04037104Analysisofhsp70mRNAexpressionoftilapiainfectedwithStreptococcusWANGRuil2HUANGYanhual，CHENMin92，LIANGWanwen2，HUANGJunl‘(1CoHegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China；2Guan

4、gxiFisheryResearchInstitute，Nanning530021，China)Abstract：ThepresentexperimentwasconductedtodetectandanalyzetheexpressionsofhspTOgeneinbrainandspleenoftilapiainfectedwithStreptococcususingreal—timefluorescencequantitative

5、PCRthe2A△口methodand7500Softwarev201Theresultsshowednosignitlcantchangesintheexpressionofhsp70mRNAinbrainafter48hinfectionwhiletheexpressionofhsp70wasincreasedinspleensignificantlyandwas55timeshigherthanthatofthecontrolaf

6、ter24hinfection，whichsuggestedthathsp70mayplayallimportantroleinimmuneresponseoftilapiainfectedwithStreptoCocCHSTheseresultslaiddownthefoundationforfurtherresearchonthefunctionofhsp70intilapiainfectedwithStreptoKeywords：

7、tilapia；hsp70gene；Streptococcus；realtimefluorescencequantitativePCR；geneexpression羅非魚屬熱帶魚類，原產(chǎn)非洲，廣泛飼養(yǎng)于熱帶、亞熱帶的淡水和咸淡水水域，為中國最具發(fā)展前景的養(yǎng)殖魚類之一。隨著羅非魚養(yǎng)殖的快速發(fā)展，各種病害逐漸成為制約其發(fā)展的重要因素，尤其是鏈球菌病許多國家和地區(qū)的羅非魚養(yǎng)殖均受其危害。另外，還有研究報道海豚鏈球菌(StreptoCOCCUS

8、iniae)可以通過傷口感染人。引起急性軟組織感染并伴有菌血癥【2】。目前，有關魚類鏈球菌病的研究已有較多報道。如鏈球菌快速PCR診斷方法建立[351、致病因子鑒定[6、疫苗研究【78|，但有關魚類感染鏈球菌后機體免疫反應發(fā)生分子機制的報道較少。熱休克蛋白(HSP)又名熱應激蛋白，是機體在應激情況下細胞內(nèi)迅速合成的一組蛋白質(zhì)具有高度保守性和應激性，普遍存在于整個生物界【9，10】。hsp70是已知HSP家族中最重要的一員在蛋白質(zhì)的折疊、

9、裝配、轉(zhuǎn)運和不可復性多肽的降解及其調(diào)控過程中起關鍵作用：當動物機體處在高溫、低溫、缺氧、重金屬、輻射、滲透壓改變等應激條件下時，其表達量顯著升高【11|。hsp70與生物體的適應能力有著重要的相關性其大量表達有助于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、改善細胞的生存能力和提高對環(huán)境脅迫或傷害的耐受性n2]。本研究應用實時熒光定量RT—PCR對吉富羅非魚感染鏈球菌后hsp70基因表達進行研究以期為進一步分析hsp70在羅非魚感染鏈球菌過程中所行使的功能奠定基礎

10、。1材料與方法11試驗材料吉富羅非魚由廣西南寧羅非魚良種場提供，體重250_50g；海豚鏈球菌由廣西水產(chǎn)研究所魚病防治研究室保存。RNA提取試劑Trizol@Reagent購自收稿日期：2009—12—22基金項目：國家科技支撐項目(2008BADB9804)作者簡介：王瑞(1984一)，男，河南長垣人，碩士研究生，主要從事水生生物病害研究工作。為通信作者，Email：hjl351@163com。萬方數(shù)據(jù)王瑞等：羅非魚感染鏈球茵后hsp

11、70基因表達研究37323實時熒光定量RT—PCR檢測hsp70基因表達為了確保實時熒光定量RTPCR反應的準確性和可重復性。每個樣品重復3次，得出CT值的標準偏差均為O02～018。利用熒光定量RT—PCR對攻毒后吉富羅非魚hsp70表達進行定量分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，羅非魚感染鏈球菌48h內(nèi)，hsp70在腦組織中表達變化不明顯；但在脾臟中表達升高，攻毒感染24h后hsp70mRNA表達量是感染前的55倍多。d酲■捌崇靛靶時f司

12、(h)Time時間(h)Time圖4羅非魚感染海豚鏈球菌后腦(左)和脾臟(右)組織hsp70mRNA表達水平Fig4Expression1evelofhsp70mRNAmbrainfleit)andspleentissue(right)oftilapiaafarinfectedbyStreptococcusiaiac3討論實時熒光定量RT—PCR具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、污染少、自動化程度高等優(yōu)點，目前已在mR

13、NA表達研究、DNA拷貝數(shù)檢測、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)測定等方面得到廣泛應用。常用的相對定量檢測方法主要有標準曲線法和2?！鳌鱟T法。其中2△△cT法在檢測過程中不需要制備標準曲線，操作相對簡便，但此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致為前提，擴增效率的偏移將影響實際拷貝數(shù)的估計。本研究通過優(yōu)化引物設計、PCR反應條件等措施，確保實時熒光定量RT—PCR擴增過程中無非特異性擴增，重復性好。靶基因hsp70和內(nèi)參基因13一ac

14、tin擴增效率基本一致以滿足2以△c1去檢測要求。HSP70基因家族是最重要、研究最廣泛的熱休克蛋白家族。在正常和應激條件下的蛋白質(zhì)代謝過程中起重要作用，其表達受環(huán)境和生理應激調(diào)控，但一些非應激條件也能調(diào)控其表達，例如細胞生長發(fā)育、病理生理狀態(tài)[刪。目前，魚類中已有虹鱒[H]、青鱔㈣和斑馬魚[1617]hsp70cDNA的報道。且有關熱應激條件下魚類hsp70mRNA表達也被廣泛研究。Molina等[18]曾分離鑒定出羅非魚hsp70基

15、因且證實熱應激條件下hsp70mRNA表達水平在所有檢測的組織中均顯著升高。本研究采用實時熒光定量RT—PCR檢測了羅非魚感染鏈球菌后hsp70mRNA在腦和脾臟中的表達變化。發(fā)現(xiàn)羅非魚感染鏈球菌后hsp70mRNA在脾臟中表達顯著升高。說明hsp70在羅非魚受鏈球菌感染后的免疫反應中有重要的作用。‘本研究從分子水平探索了鏈球菌感染羅非魚的分子發(fā)生機制，通過分析羅非魚感染鏈球菌后hsp70mRNA表達變化。揭示了hsp70在羅非魚感染鏈

16、球菌過程中起重要作用。此研究結(jié)論對探索鏈球菌感染羅非魚的分子機制、預防控制羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)以及探索羅非魚鏈球菌病的治療策略均具有重要意義。參考文獻：[1]甘西，陳明，余曉麗，李莉萍，陳漢忠，徐增輝，雷愛瑩，梁萬文，黃維義羅非魚海豚鏈球菌16SrRNA基因的序列測定和系統(tǒng)進化分析[J]水產(chǎn)學報，2007，31(5)：618—623[2]buSK，WooPC，TseH，LeungKW，WongSS，YuenKYInvasiveStrep

17、tococcusitdaeinfectiomoutsidenorthamefiea[J]JournalofClinicalMicrobiology，2003，4l(3)：100扣I009[3]MataAI，BhncoMM，DominguezL，F(xiàn)ernandezGarayzabalJF。GibelloADevelopmentofaPCRassayforStreptococcusiaiaebased011thelactateoxidase