豬2型鏈球菌MRP基因的克隆及表達(dá).pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis S.suis)是一種重要的人畜共患病原體，可引起豬腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎及敗血癥等疾病，亦可引起人類感染，導(dǎo)致腦膜炎及中毒性休克綜合征等嚴(yán)重疾患。陔菌有33個(gè)血清型，其中以2型流行最廣、致病性最強(qiáng)。豬鏈球菌有多種毒力因子，如溶菌酶釋放蛋白(MRP)，溶血素(SYL)，胞外蛋白因子(EF)等，但MRP是該菌最為重要的毒力因子之一。 本研究根據(jù)豬2型鏈球菌溶菌酶釋放蛋白編碼基因序列，

2、設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物，以豬2型鏈球菌青海株基囚組為模板擴(kuò)增MRP基因34-813bp片斷，并進(jìn)行T/A克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，成功獲得目的片斷，將目的片段定向克隆到pET-28a(+)組氨酸的下游。用鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)分子量約27 kD的融合蛋白。免疫印跡分析表明，該融合蛋白具有MRP的抗原表位。 本研究克隆了豬2型鏈球菌青海株MRP基因完整的閱讀框。編碼區(qū)長(zhǎng)度為3771bp，與已登陸的序列對(duì)比

3、發(fā)現(xiàn)此基因的閱讀框高度保守。將克隆的青海株的MRP基因插入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒，獲得了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV/MRP，對(duì)之線性化后，用pAdEasyTM系統(tǒng)，電轉(zhuǎn)化已含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)同源重組，獲得含有全MRP基因的腺病毒載體pAd/MRP，后者經(jīng)酶切充分暴露反向末端重復(fù)序列后，與脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，獲得了復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-MRt。RT-PCR檢測(cè)到重組