變形鏈球菌葡聚糖結(jié)合蛋白D基因克隆表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、齲病是最常見的感染性疾病之一，變形鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是人類齲病的主要病源菌。對其致齲機(jī)理的研究是了解齲病病因的關(guān)鍵；對其致齲過程的阻斷，是齲病預(yù)防學(xué)研究的重要目標(biāo)。變形鏈球菌的主要致齲過程包括了黏附、產(chǎn)酸和耐酸這三個重要環(huán)節(jié)，通過葡聚糖介導(dǎo)的黏附、聚集并形成菌斑生物膜是其致齲的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，葡聚糖結(jié)合蛋白(Glucan-bindingproteins，GBPs)在這一過程中起著舉足輕重的

2、作用，是變形鏈球菌重要的致齲毒力因子之一。目前已發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌擁有4種結(jié)構(gòu)各異、功能不同的GBPs。通過近年來對GbpA、B、C的研究顯示GBPs的功能涉及生物膜結(jié)構(gòu)、致齲毒力的改變、細(xì)菌的黏附和聚集，以及作為免疫防齲的免疫原等多個方面，揭示了這一蛋白家族的重要意義。葡聚糖結(jié)合蛋白D(Glucan-bindingproteinD，GbpD)是這一家族的新成員，它是2002年變形鏈球菌全基因組測序完成后，利用葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyl

3、transferases，GTFs)和葡聚糖結(jié)合蛋白A(GbpA)的葡聚糖結(jié)合區(qū)所共有的“A”重復(fù)序列搜索基因組后發(fā)現(xiàn)的，其序列中N端含有葡聚糖結(jié)合活性區(qū)，C端含有脂肪酶區(qū)。它在變形鏈球菌致齲過程中的作用還是一個未解之謎。為此本研究進(jìn)行了gbpD基因的克隆和原核表達(dá)，獲得了純化的重組GbpD蛋白(rGbpD)；構(gòu)建了gbpD基因失活菌株，并觀察其生長、產(chǎn)酸耐酸、黏附和生物膜形成能力，探索GbpD對變形鏈球菌致齲能力的影響；利用rGbpD

4、通過不同途徑免疫大鼠，并進(jìn)行免疫抑齲實驗，探索其作為免疫防齲的免疫原的可行性。 本研究共分為三個部分：第一部分：變形鏈球菌葡聚糖結(jié)合蛋白D基因的克隆、原核表達(dá)和純化常規(guī)厭氧培養(yǎng)變形鏈球菌UA159，提取基因組DNA作為模板，根據(jù)GenBank序列設(shè)計引物，PCR法擴(kuò)增gbpD基因除信號肽序列外的全長編碼區(qū)基因片段，連接T載體后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，鑒定后測序，結(jié)果與GenBank序列完全一致。 將測序

5、正確的gbpD基因片段定向插入原核表達(dá)載體pPROEXHTb，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pPROEXHTb-gbpD，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GbpD，SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果在約76KDa處出現(xiàn)新生蛋白條帶，超聲裂菌的上清中可見新生蛋白帶，表明成功誘導(dǎo)出GbpD蛋白的可溶性表達(dá)。 進(jìn)行表達(dá)菌的大體積培養(yǎng)和誘導(dǎo)，超聲裂菌，通過金屬螯合親和層析(Ni2+-NTA介質(zhì))純化獲得重組表達(dá)的GbpD蛋

6、白；所得蛋白與葡聚糖凝膠結(jié)合實驗表明它具有葡聚糖結(jié)合活性，western-blot實驗證實純化蛋白可以特異性地與抗GbpD抗體反應(yīng)。結(jié)果表明成功獲得了有活性的GbpD融合蛋白。 第二部分：變形鏈球菌葡聚糖結(jié)合蛋白D基因失活菌株的構(gòu)建、鑒定及致齲特性研究以變形鏈球菌UA159基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增739bp的gbpD基因內(nèi)部序列，連接T載體后將該內(nèi)部片段定向插入自殺載體pVA8912，酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物及插入片段大小

7、與預(yù)期值相符，表明成功構(gòu)建了打靶載體pVA8912/gbpD；將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化變形鏈球菌UA159株，挑取陽性克隆，提取基因組DNA，用PCR結(jié)合酶切鑒定發(fā)現(xiàn)gbpD基因失活株基因組中g(shù)bpD基因內(nèi)部成功插入了打靶載體片段，western-blot實驗證實該菌株不表達(dá)GbpD蛋白。結(jié)果表明成功構(gòu)建了變形鏈球菌gbpD基因失活株，為該基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。厭氧培養(yǎng)變形鏈球菌gbpD基因失活株，在不同時間點測定OD600值，繪制生長

8、曲線，發(fā)現(xiàn)gbpD基因失活株和野生菌的生長曲線無顯著性差異，表明gbpD的基因失活對變形鏈球菌的生長無顯著影響。 利用pH5.0～7.0的系列BHI液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)gbpD基因失活株和野生菌48h，測量培養(yǎng)前后的pH，觀察其產(chǎn)酸性；測量OD600值，觀察其耐酸性。結(jié)果均無顯著性差異，說明gbpD的基因失活對變形鏈球菌的產(chǎn)酸耐酸性無顯著影響。 將gbpD失活菌和野生菌菌懸液轉(zhuǎn)入無菌的96孔酶標(biāo)板中厭氧培養(yǎng)48h，黏附菌使

9、用結(jié)晶紫溶液染色，乙醇/丙酮混合液顯色，測量OD575值，以定量反映生物膜形成量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)gbpD失活菌生物膜形成量顯著低于野生菌，表明GbpD可能與變形鏈球菌生物膜形成能力有關(guān)。 掃描電鏡觀察gbpD失活菌和野生菌在釉質(zhì)片表面形成的生物膜，發(fā)現(xiàn)野生菌的生物膜厚而致密，菌細(xì)胞排列規(guī)則；而gbpD失活菌的生物膜結(jié)構(gòu)菲薄，菌細(xì)胞排列紊亂，存在很多空隙，可見長鏈狀排列的菌細(xì)胞。說明GbpD的功能可能與變形鏈球菌的生物膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。

10、 熒光標(biāo)記gbpD失活菌和野生菌，與唾液包被的羥基磷灰石粉末共同孵育后，測定羥基磷灰石沉淀的熒光值，比較粘附率的差異，發(fā)現(xiàn)gbpD失活菌的黏附率(19.7％±0.91)低于野生菌(29.5％±2.9)，差異有顯著性(P＜0.05)；當(dāng)加入抗GbpD抗體后，變形鏈球菌UA159的黏附率低于未加抗體組(P＜0.05)，說明GbpD可能對變形鏈球菌與唾液包被的羥基磷灰石的粘附有關(guān)，抗GbpD抗體對這種粘附有一定的抑制作用。 第三部分

11、變形鏈球菌葡聚糖結(jié)合蛋白D免疫防齲的動物實驗研究制備了以PLGA微球為載體的rGbpD-PLGA疫苗，測定了其載藥率和體外緩釋，掃描電鏡觀察了其形態(tài)和粒徑，結(jié)果獲得了平均直徑為1.27±0.39μm，載藥率為1.84％的微球，蛋白的體外緩釋時間可以達(dá)到4d。 利用rGbpD通過鼻粘膜滴注和頜下腺區(qū)皮下注射兩種不同途徑免疫SD大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過頜下腺區(qū)皮下注射rGbpD加弗氏佐劑誘導(dǎo)出了較高水平的血清IgG，約為其它組的10-10

12、0倍以上；以PLGA微球為載體的rGbpD-PLGA疫苗鼻腔滴注免疫也誘導(dǎo)出了顯著高于rGbpD蛋白鼻腔滴注組的SIgA水平。表明rGbpD蛋白具有免疫原性，通過適當(dāng)?shù)拿庖咄緩娇梢哉T導(dǎo)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生。 選用20d齡的SD大鼠通過上述途徑免疫，同時口腔接種變形鏈球菌，進(jìn)行誘齲實驗，以菌落計數(shù)法測定大鼠口腔變形鏈球菌數(shù)量，以Keyes齲齒評分法評價齲損程度。發(fā)現(xiàn)頜下腺區(qū)皮下注射rGbpD組和rGbpD-PLGA微球鼻腔免疫組的變形