化膿性鏈球菌溶血素O基因功能初步研究.pdf

1、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)是一類嚴格以人作為宿主的鏈球菌，廣泛存在于人的糞便和鼻咽部位，可引起從普通非侵襲性疾病如咽炎、猩紅熱、膿皰病到侵襲性和嚴重侵襲性疾病如風濕熱等疾病的常見人類專性致病菌。鏈球菌溶血素O(Streptolysin O;SLO)是鏈球菌產(chǎn)生的重要毒素之一。它不僅可以引起溶血，同時也可強烈引起真核細胞膜損傷，影響細胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程，使靶細胞釋放胞內(nèi)成分并致溶解，SLO在鏈球菌感染過程

2、中起著重要作用。生物信息分析化膿性鏈球菌溶血素O蛋白結構表明，SLO蛋白除含有由461氨基酸殘基組成的溶血活性結構域Thiol_cytolysin外，在N端還有一跨膜結構域。
　　本研究利用pET101-GENE蛋白表達系統(tǒng)，成功構建出高表達具有SLO活性的重組蛋白重組子，采用鎳柱親和層析分離技術，純化目的蛋白;純化蛋白SDS-PAGE檢測分析表明，重組蛋白與預測的溶血活性結構域的分子量相一致;溶血實驗顯示，純化重組蛋白具有溶血活

3、性。以純化的重組蛋白為免疫原，對大鼠進行4次免疫，所獲得免疫血清經(jīng)Elisa檢測，抗SLO血清效價達到1∶12800;Western Blot檢測豬鏈球菌、馬鏈球菌和化膿性鏈球菌中的鏈球菌溶血素結果顯示，抗SLO多克隆抗體僅能與化膿性鏈球菌SLO發(fā)生反應，表明所研究制備化膿性鏈球菌SLO活性結構重組蛋白抗原具有的較好特異性。
　　通過基因敲除的方法，構建化膿性鏈球菌SLO基因跨膜結構缺失株△TM和SLO基因活性結構缺失株△Thio

4、l_cytolysin，溶血活性分析驗證，無論是跨膜結構缺失株還是溶血活性結構域缺失突變株，均喪失SLO溶血，進一步通過Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，在兩株突變株培養(yǎng)基上清中不能檢測到SLO的雜交信號，因此推斷，跨膜結構缺失可能影響了SLO的分泌。比較SLO基因跨膜結構域缺失菌株，SLO溶血活性結構域缺失菌株與化膿性鏈球菌野生菌株NADase、GAPDH和SpeB等毒力因子活性，結果表明，三株菌NADase活性無明顯差異。檢測細胞表

5、面的GAPDH活性發(fā)現(xiàn)，跨膜結構缺失株與Thiol_cytolysin缺失株的活性分別是野生株的17.3％和90.5％。對化膿性鏈球菌分泌蛋白進行SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，跨膜結構缺失株SpeB的成熟明顯推遲，而缺失失活株SpeB的成熟稍微提前。細胞粘附實驗發(fā)現(xiàn)，跨膜結構缺失株與血活性結構域缺失株的相對粘附數(shù)是野生株的分別為58％和129％。同時，利用臺盼藍染色分析菌株上清液對宿主細胞通透性改變情況發(fā)現(xiàn)，兩株突變株改變細胞通透性能力