變異鏈球菌luxS基因?qū)χ慢x力影響的初步研究.pdf

1、口腔微生態(tài)環(huán)境是由許多微生物組成，這些細(xì)菌長期在口腔內(nèi)定居、生長繁殖、不斷的進(jìn)行競爭和拮抗，它們之間的競爭主要是靠密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorumsensing，QS)。細(xì)菌在微生態(tài)環(huán)境中達(dá)到一定濃度后，就產(chǎn)生調(diào)控性胞外化學(xué)信號，當(dāng)這些信號分子濃度達(dá)到一定數(shù)量值時，菌內(nèi)靶基因或者相關(guān)基因就被激活，或被抑制。通過這些信號可以調(diào)控細(xì)菌的一些功能基因，例如形成生物膜、產(chǎn)生細(xì)菌素，孢子、產(chǎn)酸、毒力反應(yīng)等，從而增強(qiáng)細(xì)菌的生存力。齲病的主要致齲菌是變異鏈

2、球菌，變異鏈球菌可以通過QS系統(tǒng)根據(jù)周圍環(huán)境的變化來進(jìn)行自身調(diào)節(jié)，以便更好適應(yīng)生存環(huán)境。其中l(wèi)uxS介導(dǎo)種屬間的QS系統(tǒng)對變鏈菌致齲力有很重要影響。本課題主要對luxS基因與變鏈菌生物膜形成和耐酸性方面關(guān)系進(jìn)行研究。
　　本研究分為三部分：
　　第一部分：敲除變異鏈球菌luxS基因，構(gòu)建變異鏈球菌luxS缺失突變株：
　　設(shè)計引物，以質(zhì)粒pEGFP-N1為模板，通過PCR得到抗卡那霉素的DNA片斷，再以變鏈菌DNA為模

3、板，PCR得到luxS基因上下游同源臂序列，將這三段DNA片斷分別按順序插入到pMD19-T載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，形成同源重組質(zhì)粒pMD19-TUKD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過在卡那霉素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到變鏈菌UA159中，利用同源重組雙交換，形成luxS突變株。對此突變株進(jìn)行PCR和哈氏弧菌生物體發(fā)光檢測。
　　第二部分：變鏈菌luxS突變株耐酸性測試：
　　接種培養(yǎng)變鏈菌UA159

4、和luxS突變株，置于pH3.0甘氨酸緩沖液中酸化，通梯度稀釋和平板計數(shù)，觀察細(xì)菌的耐酸力；變鏈菌UA159和luxS突變株pH5.0甘氨酸緩沖液預(yù)酸化處理2h，再置于pH3.0的甘氨酸緩沖液中酸化，觀察耐酸情況。結(jié)果：變鏈菌UA159和luxS突變株的耐酸力隨著時間的延長，呈現(xiàn)下降趨勢，并且luxS突變株下降更明顯。經(jīng)過預(yù)酸化處理的兩種變鏈菌耐酸性均得到增強(qiáng)。
　　第三部分：變鏈菌luxS突變株形成生物膜能力測試：
　　制