HtrA對乳牙高致齲性變異鏈球菌GTFs表達及活性的影響.pdf

1、目的：變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)的致齲性與菌斑生物膜在牙面附著密切相關(guān)，菌斑生物膜的形成又與胞外多糖(extracellular polysaccharides， EPS)關(guān)系密切。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyl transferases， GTFs)作為S.mutans致齲過程中的關(guān)鍵酶，早已被證明是影響變異鏈球菌致齲性的重要毒力因子，其催化合成了水溶性及水不溶性葡聚糖，后者不僅是胞外多

2、糖中的重要組成部分，更影響了S.mutans對牙面的黏附過程及菌斑生物膜的形成過程。高溫需要A蛋白(high temperature requirement serine proteinase A，HtrA)作為鏈球菌屬廣泛表達的一種絲氨酸蛋白，同時具有分子伴侶功能和蛋白水解活性，其在細(xì)菌的生長、壓力感受、錯構(gòu)蛋白的降解、正常蛋白的處理和成熟等方面起重要的調(diào)控作用。HtrA基因也存在于變異鏈球菌中，但其對葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)是否有

3、影響，如何影響尚未明確。故本研究旨在運用分子生物學(xué)技術(shù)，通過對比乳牙變異鏈球菌HtrA基因缺陷株和乳牙變異鏈球菌HtrA高毒力株(以下簡稱HtrA基因缺陷株、HtrA高毒力株)在體外非應(yīng)激環(huán)境中葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶信使核糖核苷酸的量、蛋白質(zhì)的量及蛋白生物學(xué)活性的差異以探究乳牙變異鏈球菌致齲過程中HtrA基因?qū)﹃P(guān)鍵毒力因子的調(diào)控作用，推導(dǎo)其致齲機制，從而判斷其在致齲過程中的重要性，為乳牙齲病的防治找到新的靶點。方法：本課題選用的菌株為乳牙高致齲

4、性變異鏈球菌HtrA基因缺陷株和高毒力株(課題組前期已獲得)及變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25175)。復(fù)蘇各菌株，分別接種至MS培養(yǎng)基，進行形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定對比。分別取鑒定后HtrA基因缺陷株、HtrA高毒力株的單一菌落接種于BHI培養(yǎng)基，37℃，厭氧(10％CO2、80%N2、10%H2)培養(yǎng)至指數(shù)期第10小時，收集菌液并調(diào)整菌液至相同濃度。取同體積兩菌液，分別提取總 RNA以實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitativ

5、e Real-time PCR)方法檢測兩菌株菌液中g(shù)tfb，gtfc，gtfd的含量。取同體積兩菌液，分別提取HtrA基因缺陷株和HtrA高毒力株的GTFs，調(diào)整蛋白濃度后分別加入等體積相同濃度(0.3%)蔗糖溶液，以蒽酮硫酸法檢測其生物學(xué)活性。以HtrA缺陷株GTFs提取物為抗原輔以福氏完全和不完全佐劑制備GTFs小鼠(BALB/c)抗體。取同批次等體積菌液，分別提取總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以 GTFs小鼠

6、(BALB/c)抗體為一抗進行蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測GTFB，GTFC，GTFD的含量。結(jié)果：經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定發(fā)現(xiàn) HtrA高毒力株、HtrA基因缺陷株和變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)菌形態(tài)基本一致，均為長短不一、鏈狀排列，革蘭染色均為紫色陽性。HtrA基因缺陷株及高毒力株均可發(fā)酵甘露醇、山梨醇、密二糖、棉子糖，水解七葉苷，但不水解精氨酸，與變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株生物學(xué)性狀相符。GTFs在Ht