太空環(huán)境對(duì)鏈球菌菌體多糖分子表達(dá)的影響.pdf

1、眾所周知，浩瀚的太空疆域無(wú)垠，有著地面上難以比擬的環(huán)境條件。目前研究證實(shí)太空環(huán)境具有強(qiáng)輻射、高真空、微重力、高潔凈等特點(diǎn)，存在著誘發(fā)生物體突變的多種因素。早在20世紀(jì)60年代，美國(guó)、蘇聯(lián)等科學(xué)家就進(jìn)行了太空環(huán)境對(duì)病毒、細(xì)菌、植物染色體等研究，發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境輻射可導(dǎo)致多種生物體DNA鏈斷裂、細(xì)胞分化異常及致突變率較高等特點(diǎn)。其后世界各航天強(qiáng)國(guó)陸續(xù)進(jìn)行太空環(huán)境對(duì)其他有生命物質(zhì)影響的探索，在宏觀層面多為誘變物的性狀、功能方面的研究，而微觀方面也

2、大多是蛋白質(zhì)及基因方面的研究。他們證實(shí)了太空環(huán)境除具改變生物體性狀及功能的作用外，還可以誘導(dǎo)基因的突變及影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。復(fù)合糖在生物的分化、繁殖、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫機(jī)制等方面具有重要的生物功能。然而，至今太空環(huán)境對(duì)多糖分子表達(dá)影響方面的研究尚少。太空環(huán)境作為一個(gè)全新的區(qū)域，已成為世界各國(guó)空間科學(xué)研究的熱點(diǎn)，其在能源、制藥等多方面發(fā)揮著重要作用。有關(guān)資料表明，若到太空環(huán)境中制藥一個(gè)月的產(chǎn)量可相當(dāng)于地球上30-60年的產(chǎn)量。我國(guó)就有幾種藥品是

3、通過(guò)衛(wèi)星載入太空后取得的，具有非常好效果。由此可見(jiàn)，利用太空環(huán)境的誘變效應(yīng)用來(lái)制藥將有著非常廣闊的前景。多糖分子是生物體中包括動(dòng)物、植物以及微生物在內(nèi)的所有有生物質(zhì)重要的組成成分，它有著維系生命的重要功能，具有組成骨性支架、組合受體、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等眾多生物活性。微生物中如細(xì)菌中存在大量的多糖分子，它有著十分重要的各種功能。據(jù)研究其具多種生物學(xué)活性，在刺激骨髓造血、引起巨噬細(xì)胞增殖及凋亡、制作多糖菌苗、抗體及治療多種疾病等方面表現(xiàn)出非常高

4、的使用價(jià)值。Α-溶血性鏈球菌作為鏈球菌種屬的一種，也稱為甲型溶血性鏈球菌，為條件致病菌，其發(fā)酵產(chǎn)物糖肽具有較高的生物學(xué)價(jià)值，在抗腫瘤、刺激骨髓造血及調(diào)節(jié)自身免疫等方面有重要作用。凝集素是一類無(wú)免疫原性、能識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其結(jié)合的專一性類似于抗原抗體反應(yīng)。根據(jù)凝集素的糖結(jié)合特異性，凝集素可分為七類：（1）D-甘露糖或（D-葡萄糖）組；（2）N-乙酰葡萄糖胺組；（3）N-乙酰半乳糖組；（4）D-半乳糖；（5）L-巖藻糖組；（6）唾液酸

5、組；（7）復(fù)合糖組。凝集素具有許多重要的生物學(xué)活性，其在抗?fàn)I養(yǎng)性、防衛(wèi)功能、細(xì)胞成熟和分化標(biāo)記、腫瘤診斷及免疫組織化學(xué)等方面發(fā)揮著重要的作用。另外，植物凝集素作為一種重要的天然產(chǎn)物，是分離純化和研究糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)與功能的重要工具，是研究糖和蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制的理想模型。其在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)、生物固氮、藥物開(kāi)發(fā)、骨髓移植及疾病鑒定等多個(gè)方面將有著廣泛的應(yīng)用。 研究目的: 在不同種類的凝集素中各選取一種有代表性的凝集素，分別是Con

6、A、WGA、SNA、RCA-Ⅰ及PHA，應(yīng)用改良的過(guò)碘酸鈉法用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記凝集素，利用凝集素的糖結(jié)合特性，檢測(cè)α-溶血性鏈球菌菌體中上述5種凝集素識(shí)別多糖分子的水平，了解進(jìn)入太空環(huán)境前及進(jìn)入太空環(huán)境后鏈球菌菌體內(nèi)多糖分子表達(dá)的狀況，旨在從多糖分子水平了解太空環(huán)境是否具有菌種的誘變作用，探討太空環(huán)境是否對(duì)鏈球菌菌體多糖分子的表達(dá)有影響，并且是否能為細(xì)菌多糖生物產(chǎn)品的篩選、增進(jìn)性能或提高產(chǎn)量等方面提供新的途徑，以及是否能為太空誘變菌生

7、物功能的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法: 1.菌種太空鏈球菌種由陜西太空生物制藥工程技術(shù)研究中心提供。系在普通α-溶血性鏈球菌種中，挑選產(chǎn)量高、敏感性大、變異幅度廣的菌株處理后，置入培養(yǎng)基封裝，裝入神舟飛船返回艙內(nèi)，進(jìn)行數(shù)天軌道運(yùn)行（近地點(diǎn)高度200公里、遠(yuǎn)地點(diǎn)高度350公里）后返回。然后經(jīng)過(guò)多次搭載不同的衛(wèi)星進(jìn)入太空環(huán)境供其誘變，并反復(fù)挑選得到的正變異太空菌種。將上述兩菌種經(jīng)過(guò)鈷60照射9000GY后滅活，保存于-

8、80℃冰箱超低溫保存，待檢。 2.菌種的破碎，蛋白多糖分子的提取采用超聲波破碎法破碎細(xì)菌，離心取上清，然后應(yīng)用鹽溶法提取蛋白多糖分子，上清中加入硫酸銨至飽和度為60%～90%，繼續(xù)攪拌10～30 min，4℃靜置3～5 h，離心，將沉淀溶于蒸餾水，采用Sevage法脫除游離蛋白，離心收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除殘余溶劑，4℃透析，冷凍干燥，得蛋白多糖粉末。計(jì)算細(xì)菌破碎率及蛋白多糖獲取率。 3.凝集素的標(biāo)記采用改良的過(guò)碘酸鈉法

9、用HRP標(biāo)記凝集素，標(biāo)記后經(jīng)過(guò)Sephadex G-200層析柱，行蛋白凝膠電泳檢測(cè)酶標(biāo)凝集素標(biāo)記后通過(guò)親和層析法的過(guò)濾效果，測(cè)酶標(biāo)抗體標(biāo)記率及ELISA測(cè)效價(jià)。 4.多糖分子的檢測(cè)檢測(cè)方法蛋白多糖分子——HRP標(biāo)記凝集素法（類似直接法ELISA），利用菌體蛋白多糖分子包被96孔酶標(biāo)板，加入標(biāo)記好的HRP-凝集素，充分結(jié)合，洗脫未結(jié)合的酶標(biāo)凝集素，通過(guò)TMB-H2O2溶液顯色，測(cè)吸收值，菌體中的多糖分子越多，與HRP標(biāo)記的凝集素

10、就結(jié)合越多，經(jīng)過(guò)顯色后OD值就越高，反之就越低。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理文中所有OD值數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，用SPSS13.0軟件包檢驗(yàn)分析，采用的具體統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若P>0.05認(rèn)為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果: 1.菌種的破碎，蛋白多糖分子的提取 結(jié)果：根據(jù)公式計(jì)算細(xì)菌相對(duì)破碎率=（1-超聲后細(xì)菌沉淀濕重/超聲前細(xì)菌沉淀濕重）、蛋白

11、多糖得率=蛋白多糖/細(xì)菌重量×100%；得出細(xì)菌相對(duì)破碎率為99%，蛋白多糖得率：地面鏈球菌為1.36%，太空鏈球菌為1.58%。 2.凝集素的標(biāo)記 結(jié)果：HRP-凝集素標(biāo)記率（測(cè)OD403nm/OD280nm得標(biāo)記率）分別為0.73、0.78、0.75、0.73及0.75；用ELISA檢測(cè)酶標(biāo)凝集素效價(jià)分別為1：1000、1：000、1：1000、1：800和1：600。 3.兩菌種多糖分子得檢測(cè)結(jié)果

12、（1）地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得ConA相關(guān)末端N-高甘露糖型多糖分子的OD值為：0.97±0.05，太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為1.18±0.03，陽(yáng)性對(duì)照組OD值為1.46±0.05，陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00，兩菌種OD值比較，P值為0.000，小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （2）地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得WGA相關(guān)末端GlcNAc多糖分子的OD值為：1.16±0.04，太空型鏈

13、球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為1.16±0.03，陽(yáng)性對(duì)照組OD值為1.46±0.03，陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00，兩菌種OD值比較，P值為0.967，大于0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （3）地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得SNA相關(guān)末端Neu5Aca2-6Gal多糖分子的OD值為：0.56±0.03，太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為0.75±0.04，陽(yáng)性對(duì)照OD值為1.35±0.04，陰性對(duì)照

14、組OD值為0.05±0.00，兩菌種OD值比較，P值為0.000，小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （4）地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得RCA-Ⅰ相關(guān)末端Galβ1-4 GlcNAc多糖分子的OD值為：1.19±0.06，太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為1.38±0.08，陽(yáng)性對(duì)照組OD值為1.42±0.05，陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00，兩菌種OD值比較，P值為0.001，小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、。 （5）地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得PHA相關(guān)末端Gal-NAC多糖分子的OD值為：0.85±0.06，太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為0.84±0.05，陽(yáng)性對(duì)照組OD值為1.44±0.06，陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00，兩菌種OD值比較，P值為0.664，大于0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 主要結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用改良的過(guò)碘酸鈉法利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記各種凝集素，采用超聲波法行細(xì)菌

16、破碎，鹽溶法提取菌體蛋白多糖分子，然后根據(jù)凝集素能特異性檢測(cè)相關(guān)多糖分子的原理，利用凝集素是一類無(wú)免疫原性、能識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其結(jié)合的專一性類似于抗原抗體反應(yīng)，利用類似ELISA法的原理，用HRP標(biāo)記的凝集素法檢測(cè)檢測(cè)兩菌種蛋白多糖分子。本實(shí)驗(yàn)中選用ConA結(jié)合N-高甘露糖型多糖分子、WGA結(jié)合末端GlcNAc多糖分子，SNA可結(jié)合末端相關(guān)Neu5Aca2-6Gal多糖分子，RCA-Ⅰ結(jié)合末端Galβ1-4 GlcNAc多糖分子及

17、PHA可結(jié)合末端Gal-NAC多糖分子的原理特性，檢測(cè)普通型α-溶血性鏈球菌及太空型鏈球菌菌體內(nèi)的多糖分子水平差異，研究?jī)煞N鏈球菌體內(nèi)多糖分子表達(dá)的情況， 結(jié)論顯示： 1、從多糖分子水平證實(shí)了太空環(huán)境具有對(duì)α-溶血性鏈球菌的誘變作用； 2、實(shí)驗(yàn)證明太空環(huán)境對(duì)α-溶血性鏈球菌多糖分子的表達(dá)有選擇性影響作用，能使ConA相關(guān)N-高甘露糖型多糖分子、SNA相關(guān)末端Neu5Aca2-6Gal多糖分子及RCA-Ⅰ相關(guān)末端G