臨床分離的豬鏈球菌體外生物被膜的構(gòu)建及影響因素分析.pdf

1、本試驗(yàn)就臨床分離的豬鏈球菌進(jìn)行體外生物被膜構(gòu)建，采用結(jié)晶紫染色法、銀染法、掃描電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡對構(gòu)建的生物被膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和半定量測定；同時(shí)研究了影響豬鏈球菌生物被膜形成的體外因素和常用抗菌藥物對生物被膜形成的影響，為臨床用藥提供一定的參考，并為進(jìn)一步研究豬鏈球菌生物被膜耐藥機(jī)理奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下。
　　 采用微量板培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色法測定臨床分離的兩株豬鏈球菌在聚苯乙烯表面上生物被膜形成的能力。結(jié)果顯示：豬

2、鏈球菌臨床分離的2型菌株YY060816和9型菌株 NJ-3培養(yǎng)1天后，通過結(jié)晶紫染色經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD550值，與浮游菌（CK）OD550值比較，差異極顯著（P<0.01），表明豬鏈球菌菌株YY060816和NJ-3能夠在酶標(biāo)板的底部粘附形成生物被膜。
　　 通過銀染法快速鑒定了體外構(gòu)建的兩株臨床分離豬鏈球菌的生物被膜。結(jié)果顯示：空白和浮游菌NJ-3的玻璃蓋玻片經(jīng)過銀染后，經(jīng)顯微鏡檢查，其上無顆粒，染色均勻，無濃密、黑染交織分布

3、的物質(zhì)出現(xiàn)，而豬鏈球菌NJ-3和YY060816菌株培養(yǎng)2天后，玻璃蓋玻片上有濃密黑染交織分布的物質(zhì)，其間隙聚集著豬鏈球菌菌體，形成了豬鏈球菌生物被膜。進(jìn)一步佐證豬鏈球菌生物被膜在體外構(gòu)建成功。
　　 通過掃描電鏡對體外構(gòu)建的兩株臨床分離豬鏈球菌生物被膜進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：偏氟酸有機(jī)濾膜表面粗糙，有較為明顯的空洞。這種結(jié)構(gòu)有利于生物被膜的形成；豬鏈球菌YY060816浮游菌菌體均勻，呈球狀，表面較為光滑，聚集在一起，其間無分泌物

4、；豬鏈球菌YY060816菌株培養(yǎng)1天生物被膜顯示（×6000倍），偏氟酸有機(jī)濾膜表面結(jié)構(gòu)有很大的變化，濾膜表面覆以粘稠樣物質(zhì)，且粘稠樣物質(zhì)內(nèi)包裹有多層菌體。12000倍時(shí)的豬鏈球菌YY060816生物被膜掃描電鏡圖片可見粘稠樣物質(zhì)和菌體更為清晰，部分粘稠樣物質(zhì)下覆有多層菌株；豬鏈球菌NJ-3菌株生物被膜掃描電鏡圖片（×6000倍），可見粘稠樣物質(zhì)較YY060816菌株更厚，被覆多層菌體。
　　 采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的刀豆蛋白

5、A（FITC-ConA）和碘化丙啶（PI）兩種熒光染料對玻璃蓋玻片上培養(yǎng)的豬鏈球菌NJ-3生物被膜進(jìn)行染色，使用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示：經(jīng)滅菌處理的空白蓋玻片未被染成綠色和紅色，說明蓋玻片未被細(xì)菌和多糖污染可以作為載體；培養(yǎng)12 h的豬鏈球菌NJ-3浮游菌經(jīng)FITC-ConA染色，沒有綠色熒光物質(zhì)，而菌體被PI染成紅色，說明培養(yǎng)12 h的NJ-3浮游菌不分泌多糖；生物被膜組經(jīng)FITC-ConA染色有綠色熒光物質(zhì)出

6、現(xiàn)，而且綠色熒光物質(zhì)將染成紅色的豬鏈球菌包裹，并且培養(yǎng)3天的豬鏈球菌所形成的生物被膜較較1天的綠色熒光物質(zhì)密度高，說明在蓋玻片上培養(yǎng)1天即能形成生物被膜，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，生物被膜的形成逐漸增加。
　　 采用結(jié)晶紫染色法研究了培養(yǎng)基中葡萄糖和氯化鈉濃度對豬鏈球菌NJ-3和98012菌株粘附性的影響，并對臨床分離的46株豬鏈球菌生物被膜形成能力進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加，豬鏈球菌NJ-3和98012菌株在微

7、孔板上的粘附性增強(qiáng)；培養(yǎng)基中NaCl濃度為0.5％時(shí)，兩株豬鏈球菌的粘附性最強(qiáng)，隨著NaCl濃度的繼續(xù)增大，粘附性減弱；不同豬鏈球菌臨床分離菌株具有不同的生物被膜形成能力，在46株豬鏈球菌中，9型菌株形成生物被膜的能力較強(qiáng)，在28株2型的豬鏈球菌菌株中，OD550值大于0.1的有3株（10.7％），小于0.1的有25株（89.3％），而16株9型的豬鏈球菌中，OD550值大于0.1的有13株（81.3％），小于0.1的有3株（18.7％