豬鏈球菌生物被膜形成及致病機(jī)理研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，ss)是豬的重要致病菌，可以引起腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等疾病，也可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員感染和死亡.根據(jù)其被膜抗原的不同，豬鏈球菌分為33個(gè)血清型(1-31，33，1/2)，其中豬鏈球菌2型(ss2)流行最廣，分離率最高，可以通過直接接觸傳染人．
　　 細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境、有利于生存而特有的生命現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)菌吸附于活組織或無活力的組織表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋

2、白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，使細(xì)菌相互粘連并將其自身克隆聚集纏繞其中形成的膜樣物。在自然環(huán)境中有大量的細(xì)菌是以生物被膜形式存在，不同于實(shí)驗(yàn)室研究的浮游態(tài)的細(xì)菌。生物被膜在細(xì)菌的致病性上起著非常重要的作用。目前的研究集中在豬鏈球菌形成的生物被膜增加了對宿主的抵抗力及耐藥性增加方面。然而毒力和生物被膜形成能力的相互關(guān)系以及生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌各種生物學(xué)特性的差異研究甚少。本研究首次建立豬鏈球菌體內(nèi)體外生物被膜模型，比較了生物被膜狀態(tài)下與浮游態(tài)

3、細(xì)菌在粘附、毒力、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)之間的差異，并通過蛋白結(jié)晶和基因缺失系統(tǒng)研究了密度感應(yīng)系統(tǒng)(LuxS蛋白)的結(jié)構(gòu)及對生物被膜的影響研究。l豬鏈球菌體內(nèi)體外生物被膜模型的建立和結(jié)構(gòu)觀察
　　 豬鏈球菌可粘附于細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，可能使豬產(chǎn)生生物被膜狀態(tài)的感染。利用96孔微板法在體外建立了生物被膜模型，用激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察到豬鏈球菌在體外能夠形成生物被膜并觀察到生物被膜的形態(tài)。首次利用斑馬魚模型建立了豬鏈球菌體內(nèi)生物被

4、膜感染的模型，采用光鏡和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌在斑馬魚體內(nèi)呈細(xì)菌聚集趨勢，發(fā)現(xiàn)了類似于“生物被膜’樣的細(xì)菌集簇。為進(jìn)一步研究豬鏈球菌的感染機(jī)制及致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。2豬鏈球菌生物被膜和浮游態(tài)生物學(xué)特性比較研究
　　 豬鏈球菌2型( SS2)可以在惡劣的環(huán)境中存在而形成生物被膜。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株ZY05719和HA9801形成生物被膜能力強(qiáng)于無毒株TI5。比較了生物被膜狀態(tài)下與浮游態(tài)的細(xì)菌粘附HEp-2細(xì)胞的能力、毒力、毒力基因

5、的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與浮游態(tài)相比粘附率下降了58％，半數(shù)致死量(LD50)增加了40倍．熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)細(xì)胞與浮游態(tài)細(xì)胞相比gdh，cps2和mrp基因表達(dá)下調(diào)，而sly和gapdh表達(dá)上調(diào)．生物被膜和浮游態(tài)下滅活疫苗保護(hù)率分別為60%和46%。這一結(jié)果提示，細(xì)菌致病力和形成生物被膜的能力之間可能存在一定的聯(lián)系：細(xì)胞粘附、基因表達(dá)水平和毒力在生物被膜細(xì)胞和浮游細(xì)胞之間有較大差異。提示強(qiáng)毒株可能通過形成生物被膜而減弱其毒力，

6、從而達(dá)到在宿主體內(nèi)持續(xù)性感染的目的。3生物被膜和浮游生長狀態(tài)的豬鏈球菌比較/免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 豬鏈球菌2型(ss2)能夠在體外形成生物被膜。利用比較蛋白組學(xué)和免疫蛋白組學(xué)方法，研究了SS2生物被膜狀態(tài)與浮游態(tài)下細(xì)菌總蛋白以及免疫原性蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果表明，生物被膜狀態(tài)下6個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，7個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。采用豬鏈球菌康復(fù)血清，與生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌的總蛋白進(jìn)行免疫蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)有9種蛋白具有免疫原性，其中5個(gè)蛋白首次

7、在豬鏈球菌中報(bào)道具有免疫原性，其余4個(gè)蛋白在生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)下均被鑒定具有免疫原性。這些結(jié)果表明細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下與浮游態(tài)相比，有著不同的蛋白表達(dá)，所鑒定的新免疫原性的蛋白可作為防治生物被膜感染的疫苗候選抗原，特別是4種在兩種狀態(tài)都被鑒定的共同抗原可能有效的防止生物被膜和急性感染。4豬鏈球菌S．核糖基高半胱氨酸酶的表達(dá)、晶體結(jié)構(gòu)和功能
　　 S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)是S．腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的重要的一種酶，它可

8、代謝產(chǎn)生細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)中的信號(hào)分子AI-2。以豬鏈球菌2型S．核糖基高半胱氨酸酶為研究對象，利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)獲得大量LuxS蛋白，通過對LuxS進(jìn)行結(jié)晶篩選和優(yōu)化獲得質(zhì)量較好的晶體；對蛋白晶體進(jìn)行X射線衍射實(shí)驗(yàn)，獲得X射線衍射數(shù)據(jù)；通過數(shù)據(jù)分析解析了其三維精細(xì)結(jié)構(gòu)，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜方法確定鏈球菌S．核糖基高半胱氨酸酶中含二價(jià)金屬離子鋅。在此結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對LuxS作為豬鏈球菌2型區(qū)別于其他細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了討論

9、，揭示該酶可能的進(jìn)化機(jī)制，為防控豬鏈球菌的藥物設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)．5豬鏈球菌2型HA9801 luxS基因缺失株的構(gòu)建及其特性已報(bào)道豬鏈球菌2型( SS2)的luxS在調(diào)控各種行為及種間信號(hào)中起著非常重要的作用，然而luxS基因在SS2中的作用還不清楚．利用同源重組原理構(gòu)建了SS2的luxS缺失株和互補(bǔ)株，并比較了各菌株在細(xì)胞粘附、溶血性、形成生物被膜能力、毒力及毒力基因表達(dá)中的差異。結(jié)果表明所有檢測的SS2都含有l(wèi)uxS基因，缺失株的溶