豬鏈球菌2型莢膜缺失株的構建及其致病性研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一種重要的人畜共患病的病原體。迄今為止，S.suis2已在包括歐美、澳大利亞和中國在內的20多個國家和地區(qū)引發(fā)了人感染的病例。尤為值得關注的是，我國的江蘇和四川兩省分別在1998和2005年發(fā)生兩起豬鏈球菌感染豬和人的公共衛(wèi)生事件，感染者出現(xiàn)了國內外罕見的鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本課題

2、組(南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所)對1998年和2005年流行的強致病株98HAH12，05ZYH33(兩株均分離自STSS病人)及無毒株05JYS68(分離自江蘇健康豬)進行了全基因組測序，并對基因組進行了注釋。注釋結果顯示，05ZYH33中含有莢膜合成基因cps2B。同源比對發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列與肺炎鏈球菌的莢膜多糖合成蛋白Wzd的氨基酸序列相似性為58％。大量研究表明，莢膜多糖(capsular polysaccharide，C

3、PS)是多種病原菌的毒力因子，在細菌致病過程中發(fā)揮重要的作用。為闡明05ZYH33中CPS與致病性的關系，我們鎖定CPS對其進行深入的生物學功能研究，實驗內容和結果主要包括以下幾方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B基因敲除突變株的構建：構建中間為觀霉素抗性基因，兩側為cps2B編碼基因上、下游同源序列的基因敲除質粒，通過同源重組篩選cps2B基因敲除突變體。PCR分析和Southern雜交結果均顯示cps2B基因完

4、全被壯觀霉素抗性基因替代，基因敲除突變體構建成功。篩選獲得05ZYH3莢膜合成基因cps2B敲除突變體，為闡明莢膜多糖在豬鏈球菌致病過程中的作用奠定了基礎。 2、cps2B基因缺失對細菌基本生物學性狀的影響：在相同的條件下，觀察S.suis2野生株05ZYH33與突變株△cps2B的基本生物學性狀有無明顯差異。結果發(fā)現(xiàn)，cps2B編碼基因敲除后，細菌能穩(wěn)定生長，在瓊脂血平板上，敲除株與野生株溶血活性及細菌形態(tài)并無差別。cps2B

5、基因敲除后，革蘭染色結果發(fā)現(xiàn)細菌成鏈能力降低，細菌更為散在；電鏡結果顯示突變體莢膜合成能力喪失，成功獲得了05ZYH33莢膜缺失株，△cps2B在凝集實驗中不再與莢膜特異性抗血清發(fā)生凝集反應。 3、cps2B基因缺失對細菌基本生物學功能的影響：在相同條件下，觀察S.suis2野生株05ZYH33與突變株△cps2B在人和仔豬全血中的生存能力，同時觀察野生株和突變株與上皮細胞的粘附能力，結果顯示突變株△cps2B無論在人還是仔豬的

6、全血中生存能力大為降低，更容易被全血清除，而與上皮細胞的粘附能力大為增強。 4、突變株△cps2B和野生株動物致病實驗：在小鼠模型中，將28日齡Balb/c品系小鼠30只平均分為3組。第1組通過腹腔接種豬鏈球菌2型強毒株稀釋菌液，每只Iml，約合108CFU細菌；第2組以相同方式接種該突變株△cps2B稀釋菌液；第3組注射相同體積的THS作為陰性對照。野毒組小鼠在2日內死亡8只，而突變組小鼠只有部分小鼠輕微發(fā)病，無死亡發(fā)生，48

7、h內全部恢復健康。突變株基本對小鼠喪失毒力。 5、突變株△cps2B和野生株動物保護性實驗：用突變株△cps2B免疫Balb/c小鼠，同時設立陰性對照，收集抗血清，ELISA檢測抗血清效價。結果表明△cps2B能刺激小鼠機體產生免疫應答，免疫小鼠產生的抗體效價大于1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死劑量的S.suis2高致病性菌株05ZYH33攻擊小鼠，觀察對照組和免疫組小鼠的存活情況，計算存活率，統(tǒng)計學軟件分析各免疫