豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株srtA基因缺失株的構(gòu)建及其毒力分析.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS2)是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌，同時(shí)也給從業(yè)人員帶來嚴(yán)重的威脅。根據(jù)莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)抗原性的不同，可將其分為35個(gè)血清型(1～34，1/2)。主要致病血清型為SS1、SS2、SS1/2、SS7、SS9和SS14，其中以SS2流行最廣、致病性最強(qiáng)。已知的與致病性相關(guān)的毒力因子主要有莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白(muramini

2、dase releasedprotein，MRP)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)等，但該菌致病機(jī)制不明，新的毒力因子有待發(fā)掘。本實(shí)驗(yàn)對(duì)普遍存在于革蘭陽性菌中的重要膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sortase進(jìn)行了初步功能研究，證實(shí)Sortase編碼基因srtA及其類似蛋白在ss2中的存在；同時(shí)構(gòu)建了srtA基因的缺失株，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺失株毒力與野毒株相比有所下降；成功克隆并原核表達(dá)了05

3、zYH33的sortase蛋白，重組蛋白具有一定的免疫原性。 1、豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株srt基因同源序列分析及srtA的表達(dá)借助生物信息學(xué)軟件對(duì)SS2人源強(qiáng)毒力株05ZYH33基因組序列進(jìn)行同源性檢索，確定05ZYH33基因組編碼Sortase及其相關(guān)家族蛋白的數(shù)量和分布情況，得到6個(gè)與Sortase編碼基因同源的序列，其中SrtA及Sortase-like歸屬sortase家族中的A組，SrtBCD和SrtE屬B組，1個(gè)sor

4、tase-like基因?yàn)閲?guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)。將srtA基因克隆于原核細(xì)胞E.coli DH5α中高效表達(dá)，重組表達(dá)產(chǎn)物可與SS2的兔多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。此外，制備Sortase鼠多抗血清，間接ELISA檢測(cè)的鼠多抗血清效價(jià)達(dá)1∶6400。 2、豬鏈球菌srtA基因敲除突變株的構(gòu)建及其特性研究構(gòu)建中間為壯觀霉素抗性基因，兩側(cè)為srtA編碼基因上、下游同源序列的基因敲除載體，通過同源重組構(gòu)建srtA基因缺失的突變株；PCR和Sou

5、thern雜交鑒定突變株，篩選到1株srtA編碼基因完全被壯觀霉素抗性基因替代的突變株05ZYH33△srtA，體外觀察突變株05ZYH33△srtA的基本生物學(xué)性狀，發(fā)現(xiàn)其革蘭氏染色及溶血性與野毒株相比沒有明顯變化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)srtA缺失株的毒力與野毒株相比有所下降。為進(jìn)一步探討豬鏈球菌2型分子致病機(jī)理奠定了研究基礎(chǔ)。 3、豬鏈球菌2型Sortase蛋白單克隆抗體的制備以表達(dá)、純化去除跨膜區(qū)的Sortase蛋白為免疫原，常