馬鏈球菌獸疫亞種類M基因缺失株的構(gòu)建及生物特性分析.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ)對集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害嚴重，同時對養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅，類M蛋白是該菌一種重要的表面蛋白和毒力因子，具有調(diào)理素功能，且能夠抵抗的吞噬細胞對其的吞噬作用。本試驗構(gòu)建了類M蛋白基因(szp)的缺失株，在分子水平上對馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的粘附機制進行了研究，同時，通過動物模型評價了該突變株的毒力和免疫原性。因此本研究所構(gòu)

2、建的ATCC35246的類M蛋白基因缺失突變?nèi)醵揪辏瑸樵摼闹虏C制及引起的豬鏈球菌病的防控進行了有益的探索。 1.鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株類M蛋白基因缺失株的構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的馬鏈球菌獸疫亞種豬源ATCC35246株的類M蛋白基因序列，設(shè)計和合成一對基因步移引物，并以ATCC35246株的基因組DNA為模板，通過基因步移技術(shù)，擴增出類M蛋白左右兩翼基因。為了敲除類M蛋白基因，以ATCC35246為始發(fā)菌株，

3、構(gòu)建基因重組質(zhì)粒PUC-18，利用同源重組的原理構(gòu)建了ATCC35246的類M蛋白基因缺失突變菌株(缺失了類M蛋白基因共1090bp)并對該菌株的致病力、小鼠模型的免疫保護作用進行了研究。結(jié)果表明，ATCC35246的類M蛋白基因缺失突變菌株對實驗小鼠的致病性明顯減弱；突變株能對小鼠提供良好的免疫保護，半定量RT-PCR示，免疫鼠IL-2、IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高.所以經(jīng)免疫的小鼠可以獲得良好的被動免疫保護作用。為了進一步確定s

4、zp基因的具體作用，進行了馬鏈球菌獸疫亞種szp基因缺失株的基因互補實驗。實驗證實基因互補株與野生株的生物特性基本一致。因此本研究所構(gòu)建的ATCC35246的szp基因缺失突變?nèi)醵揪昕勺鳛轭A防ATCC35246感染的疫苗候選株，為最終研究制出馬鏈球菌獸疫亞種鏈球菌的基因工程菌苗奠定基礎(chǔ)。 2.類M蛋白及其基因缺失株對HEp-2細胞的粘附作用 采用通用的模式細胞HEp-2細胞，研究馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株類M

5、蛋白的粘附作用。結(jié)果顯示，用重組的ATCC35246株類M蛋白預處理HEp-2細胞，當類M蛋白的量達到3.2μg/200μL，可顯示為陽性；用重組表達的類M蛋白單抗處理類M蛋白，可抑制其對HEp-2細胞的粘附，在1.8μg/500μL能完全抑制它對HEp-2細胞的粘附，說 明其單抗對應的抗原表位在細胞粘附中具有決定性作用。同時發(fā)現(xiàn)，親本株及szp基因缺失株均對HEp-2細胞有黏附和侵襲力，但szp基因缺失株黏附能力降低50％以上