馬鏈球菌獸疫亞種間接ELISA診斷方法的建立與應用.pdf

1、根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的馬鏈球菌獸疫亞種重要保護性抗原類M蛋白(M-likeprotein)的編碼基因Szp的基因序列，設計出一對引物。以馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246菌株的全基因組DNA為模板，通過多聚酶鏈式反應擴增出目的基因并定向克隆至原核表達載體pET-28a(+)中，通過PCR鑒定和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定之后，確認重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，對陽性菌落進行增菌培養(yǎng)，并用異丙基-β-D-

2、硫代吡喃半乳糖(IPTG)誘導其在低溫下進行表達。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，表明類M蛋白獲得了良好的表達，且以可溶性蛋白形式存在于上清中，蛋白分子量與推導值一致。Western-blot免疫印跡反應顯示，所得目的蛋白可被豬源ATCC35246株康復血清識別，表明其具有良好的免疫原性。
　　 隨后用親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析純化蛋白后，通過Bradford蛋白定量法繪制了測定蛋白濃度的標準曲線，并運用統(tǒng)計學知識，建立了回歸

3、方程，對獲得的類M蛋白進行定量分析，測定了較為精確的類M蛋白的濃度。在此基礎上，用類M蛋白作為包被抗原，采用方陣滴定法，確定了抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度，并通過一系列的優(yōu)化試驗，確定了最佳反應試劑和操作規(guī)程，并組建了間接ELISA反應試劑盒，隨后通過敏感性試驗、特異性試驗、重復性試驗和保存期試驗等對該試劑盒的敏感性、特異性和長期應用與保存條件進行了檢驗，并通過對實驗室保存的40份標準陰性血清進行了測定，確定了平均值，標準偏差，根據(jù)

4、經(jīng)驗公式確定了陰陽性臨界值。從而為后續(xù)的流行病學調(diào)查奠定了基礎。
　　 本試驗對實驗室保存的豬血清400份，實驗室保存的血清主要來自河南、上海、山東、安徽地區(qū)，采集自南京地區(qū)部分豬場的80份血清、肉聯(lián)廠的豬血清100份，用已經(jīng)建立的ELISA操作規(guī)程對其進行了檢測;對常用試驗動物小鼠、家兔在試驗前采集其血清各50份進行檢測，以確定南京和揚州地區(qū)部分試驗動物感染馬鏈球菌獸疫亞種的情況;對南京地區(qū)部分養(yǎng)牛場的血清50份進行了檢測，以