延邊黑熊源鏈球菌的分離鑒定及PCR診斷方法的建立.pdf

1、鏈球菌?。⊿treptococosis)主要是由β溶血性鏈球菌引起的多種人獸共患病的總稱。動物鏈球菌病中主要以豬、牛、羊、馬、雞較為常見。近幾年來，水貂、牦牛、兔和魚類也有發(fā)生鏈球菌病的報道。人鏈球菌病以猩紅熱為多見。鏈球菌病的臨診表現(xiàn)中存在多樣性，在病理變化過程中能夠引起化膿創(chuàng)和菌血癥，也可引起局部感染。鏈球菌的種類繁多，在自然界分布廣泛，主要通過呼吸道和空氣傳播，其次也可通過損傷的皮膚感染傳播，主要引起大葉性肺炎、支氣管炎、腦膜炎、

2、化膿性關(guān)節(jié)炎、敗血癥等，能產(chǎn)生多種外毒素和酶，可溶解紅細(xì)胞，對動物有致死作用。有資料顯示，鏈球菌引起的上述疾病時有發(fā)生，可感染人、家畜、花鯨、狐等野生動物，在生后數(shù)日內(nèi)的幼兒或幼齡動物大多數(shù)因腦膜炎死亡率較高，造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量。
　　近幾年來，鏈球菌病在延邊州的豬及其他動物的流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大，發(fā)病率和感染率不斷上升，當(dāng)今已成為嚴(yán)重威脅延邊畜牧業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，因此，分離鏈球菌本地株、建立檢測方法以及疫苗的研究等是十分必要

3、的。
　　為了分離鑒定黑熊鏈球菌延邊株，以及預(yù)防鏈球菌在該區(qū)養(yǎng)熊業(yè)的流行，本試驗利用發(fā)病死亡熊病料成功分離出三株致病菌，并應(yīng)用 H2O2試驗、奧譜托欣實(shí)驗、膽汁溶菌實(shí)驗等生化反應(yīng)來鑒定此三株菌的生化特性，以及進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢以及 AMOS-PCR分子生物學(xué)診斷進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果顯示，在改進(jìn)的血液瓊脂培養(yǎng)基上分離出了特異性的菌落；熊分離的菌株在 H2O2試驗反應(yīng)中沒有氣泡產(chǎn)生，膽汁溶菌實(shí)驗生化鑒定結(jié)果為陰性，革蘭氏染色鏡檢可見清

4、晰的革蘭氏陽性球形菌體 AMOS-PCR顯示該菌株有760 bp和在建立的特異性 PCR診斷方法中的598 bp兩條清晰條帶，以上結(jié)果初步證明所分離的菌體為鏈球菌。
　　根據(jù)16SrRNA細(xì)菌鑒定通用引物，以提取的分離株鏈球菌的總 DNA為模板 PCR擴(kuò)增得到了特異性目的基因,克隆到 pMD18-T載體上，送生物試劑公司測序，在 NCBI上進(jìn)行比對，與鏈球菌的符合率為99.8％，在此基因序列上選取一段基因設(shè)計一對引物，建立 PCR