豬鏈球菌穿血腦屏障毒力因子的篩選及鑒定.pdf

1、豬鏈球菌血清2型(Streptococcussuisserotype2)是一種重要的人畜共患病病原體,豬鏈球菌感染具有較高的病死和病殘率,其最主要的臨床癥狀是腦膜炎,與其它細(xì)菌性腦膜炎相似,我們認(rèn)為豬鏈球菌致腦膜炎的過程也是多步驟的,其中最關(guān)鍵的步驟是豬鏈球菌如何穿過血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
　　BBB是重要的結(jié)構(gòu)和功能屏障,在維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)免受血液中的有害物質(zhì)和微生物

2、的侵入方面起重要作用,其主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成,而腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是其最主要的組成部分。因此,豬鏈球菌與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的研究對揭示豬鏈球菌穿過BBB的作用機(jī)制,進(jìn)而研究豬鏈球菌致腦膜炎的機(jī)制均有重要意義。
　　我們課題組在前期工作中,利用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3),這一國內(nèi)外公認(rèn)的模擬BBB較好的細(xì)胞系,建立了人BBB體外模型,并確認(rèn)了豬鏈球菌以細(xì)胞旁的途徑穿過BBB。本

3、研究旨在利用建立的人BBB體外模型,篩選可能影響豬鏈球菌穿BBB能力的毒力因子,并研究分析其作用機(jī)制。本研究篩選了本課題組前期發(fā)現(xiàn)的多個(gè)可能毒力基因如SSU05_1000,SSU05_MRP,SSU05_1815及SSU05_1664等在豬鏈球菌穿血腦屏障過程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,敲除SSU05_1000,SSU05_MRP基因后,豬鏈球菌穿BBB能力顯著下降,而敲除其它毒力基因?qū)ωi鏈球菌穿BBB能力無顯著影響。因此,我們推測SSU0

4、5_1000,SSU05_MRP很可能在豬鏈球菌穿BBB過程中發(fā)揮重要作用。
　　SSU05_1000是本課題組新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞壁蛋白,具有較強(qiáng)的免疫原性。本課題組前期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:SSU05_1000有助于豬鏈球菌抵抗免疫細(xì)胞的殺傷,從而實(shí)現(xiàn)血中存活,有助于細(xì)菌進(jìn)入腦部。但是,具體的作用機(jī)制并不清楚,且目前尚未有對該蛋白的研究報(bào)道。
　　為了研究SSU05_1000在豬鏈球菌穿BBB過程中作用機(jī)制,本研究對該基因進(jìn)行了重組

5、表達(dá)和純化。首先,構(gòu)建pET30a-SSU05_1000重組表達(dá)質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)中。IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳顯示該蛋白為在細(xì)菌裂解液上清中,為可溶性表達(dá),然后利用鎳親和層析法對該蛋白進(jìn)行純化,得到純度90％以上的重組SSU05_1000蛋白,并用TritonX-114去除污染的脂多糖(LPS)。
　　為了驗(yàn)證SSU05_1000基因在豬鏈球菌穿血腦屏障過程中的作用,將獲得的重組蛋白預(yù)處

6、理hCMEC/D3細(xì)胞,然后評價(jià)05ZYH33△1000的穿過能力。結(jié)果表明:SSU05_1000蛋白可以使05ZYH33△1000穿膜能力恢復(fù)到05ZYH33野生株水平。為了分析豬鏈球菌穿血腦屏障過程中激活的信號通路,本研究篩選了多種信號通路的抑制劑。研究結(jié)果表明:p38MAPK和JNK通路抑制劑預(yù)處理hCMEC/D3細(xì)胞后,能顯著降低豬鏈球菌穿血腦屏障能力。提示:豬鏈球菌在穿血腦屏障過程中可能需要激活MAPK信號通路。在此基礎(chǔ)上,本