豬鏈球菌毒力因子與免疫原性蛋白的篩選及斑馬魚模型轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）是豬的重要致病菌，在全世界廣泛分布，可以引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及急性死亡，也可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員感染和死亡。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌分為35個(gè)血清型（1-34型，1/2型），其中豬鏈球菌2型(SS2)流行最廣，從發(fā)病動(dòng)物中分離率最高。此外，豬鏈球菌9型(SS9)也是一個(gè)重要致病血清型，與斷奶仔豬的敗血癥、腦膜炎和肺炎的爆發(fā)有關(guān)，在澳大利亞、荷蘭、比利時(shí)、德國等國家SS9流

2、行較廣。流行病學(xué)調(diào)查表明，在中國SS9也經(jīng)常從病豬中分離到，并逐步呈上升趨勢(shì)。目前，豬鏈球菌毒力因子及免疫原性蛋白的研究大都限于SS2，SS9的相關(guān)研究很少。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選SS9毒力因子、SS9免疫原性蛋白、SS2與SS9共同抗原及基因芯片方法對(duì)豬鏈球菌斑馬魚模型的驗(yàn)證。
　　 1 SS9分泌蛋白比較蛋白組學(xué)研究
　　 應(yīng)用比較蛋白組學(xué)方法，從兩株不同毒力的SS9菌株分泌蛋白中檢測(cè)致病性差異相關(guān)蛋白，以期發(fā)

3、現(xiàn)SS9新的候選毒力因子。SS9菌株GZ0565與SH040917分別分離自病豬與健康豬。用斑馬魚模型評(píng)價(jià)兩株細(xì)菌毒力，GZ0565對(duì)斑馬魚半數(shù)致死量為3.8×105cfu/魚，而SH040917對(duì)斑馬魚不致病。同時(shí)，這兩株細(xì)菌在豬鏈球菌已知毒力因子分布方面也存在差異。將病豬分離株GZ0565中有而健康豬分離株SH040917中沒有的差異分泌蛋白經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS),或MALDI-TOF-TOF

4、-MS鑒定，分屬于13種蛋白。其中5種蛋白報(bào)道與毒力相關(guān)(DNA核酸酶、O-乙酰絲氨酸裂解酶、含LysM結(jié)構(gòu)的肽聚糖結(jié)合蛋白、磷酸甘油酸變位酶、5’－核苷酸酶），再用Southern雜交從基因水平驗(yàn)證，其中4種候選毒力因子對(duì)應(yīng)基因在健康豬分離株SH040917中沒有，這些蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步了解SS9的致病機(jī)制。
　　 2 SS9表面蛋白免疫蛋白組學(xué)研究
　　 利用免疫蛋白組學(xué)方法，以SPF小鼠抗SS9免疫血清作為一抗

5、，與通過二維凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的SS9菌株GZ0565細(xì)胞壁蛋白雜交，從中鑒定12個(gè)免疫反應(yīng)性蛋白斑點(diǎn)。從凝膠中切割相應(yīng)的蛋白斑點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS鑒定，屬于8種免疫原性蛋白。它們分別是：精氨酸脫亞氨酸酶、胞外溶解物結(jié)合蛋白、延長因子TS、腦啡肽、多肽ABC運(yùn)載體多肽結(jié)合蛋白、丙酮酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、果糖二磷酸醛縮酶。上述免疫原性蛋白對(duì)應(yīng)基因在SS9菌株中較保守，可作為SS9亞單位疫苗的

6、候選成分。
　　 3應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)方法篩選SS2與SS9共同抗原
　　 SS2及SS9都可致豬鏈球菌病。研制共同疫苗是防控由SS2與SS9引起豬鏈球菌病的有效手段。采用免疫蛋白組學(xué)的方法，鑒定SS2與SS9共同抗原，為研制共同疫苗提供理論基礎(chǔ)。分別以SPF小鼠抗SS2免疫血清、SS9免疫血清及免疫前對(duì)照血清作為一抗，與通過二維凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的SS2菌株HA9801細(xì)胞壁蛋白雜交，通過比較免疫轉(zhuǎn)印蛋白圖譜的差異，

7、從中鑒定7個(gè)共同免疫反應(yīng)性蛋白斑點(diǎn)。從二維凝膠中切割相應(yīng)的蛋白斑點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析鑒定，分屬于4種蛋白：精氨酸脫亞氨酸酶、延長因子TS、O-乙酰絲氨酸裂解酶和1－磷酸果糖激酶。從SS9菌株GZ0565中克隆表達(dá)這4種蛋白，用SPF微型豬SS2康復(fù)血清通過免疫轉(zhuǎn)印方法進(jìn)一步驗(yàn)證其免疫原性。上述免疫原性蛋白對(duì)應(yīng)基因在SS2和SS9菌株中相當(dāng)保守，可作為SS2和SS9疫苗的候選成分。
　　 4斑馬魚感染豬鏈球菌后轉(zhuǎn)錄水

8、平的變化
　　 豬鏈球菌是豬的重要致病菌，然而，用普通豬判定細(xì)菌的毒力問題較多，結(jié)果不確定，阻礙了豬鏈球菌致病機(jī)理的研究。與豬相比，斑馬魚價(jià)廉易得、體型小、操作方便，特別適合于突變庫中突變株毒力的判定。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地將斑馬魚作為豬鏈球菌的感染模型，并且被國際獸疫局所引用。應(yīng)用Affymetrix斑馬魚芯片研究斑馬魚感染SS2菌株HA9801后基因表達(dá)的變化。在總共有14900轉(zhuǎn)錄本的芯片中，有189個(gè)基因發(fā)生變化，其中125

9、個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，64個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。在上調(diào)的基因中，若干基因的功能與免疫和炎癥反應(yīng)、凝血過程、補(bǔ)體激活及急性階段反應(yīng)及應(yīng)激或防御反應(yīng)有關(guān)，研究表明其中有三個(gè)基因（編碼血清淀粉樣蛋白A、基質(zhì)金屬蛋白酶9和凋亡相關(guān)半胱氨酸蛋白酶）在其它物種中與豬鏈球菌感染后的反應(yīng)相同。下調(diào)基因有肌肉特異基因和與運(yùn)動(dòng)或行為的正調(diào)控有關(guān)的基因。挑選12個(gè)基因應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與芯片的數(shù)據(jù)吻合。上述發(fā)現(xiàn)有助于用斑馬魚模型進(jìn)一步探索豬鏈球菌