豬鏈球菌2型三種免疫原性蛋白基因片段的串聯(lián)表達(dá)及其斑馬魚(yú)免疫保護(hù)試驗(yàn).pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype2）是人和多種動(dòng)物的病原菌，許多研究表明其免疫原性蛋白可對(duì)豬產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，可作為亞單位疫苗的候選單位。斑馬魚(yú)（Danio rerio）具有完整的免疫系統(tǒng)，研究表明，斑馬魚(yú)可用于豬鏈球菌2型感染及其疫苗篩選。
　　 以豬鏈球菌2型 HA9801株基因組 DNA為模板分別擴(kuò)增 MRP（Muramidase-released protein，溶菌酶釋放蛋白）、通過(guò)

2、免疫蛋白組學(xué)鑒定的免疫原性蛋白HM6（Dihydrolipoamide dehydrogenase，二氫硫辛酰胺脫氫酶）及GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，磷酸-3-甘油醛脫氫酶）抗原性較好的基因片段，定向克隆至表達(dá)載體pET-28a（+）中，重組質(zhì)粒mrp-pET28a、hm6-pET28a及gapdh-pET28a經(jīng)限制性酶切鑒定后測(cè)序。結(jié)果表明插入片段大小分別為531、9

3、64、1005bp，與NCBI上豬鏈球菌2型基因序列相比，同源性均達(dá)到99％。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)分子量分別約為26.0、40.5及41.7kDa的融合蛋白，用豬鏈球菌2型HA9801株豬康復(fù)血清與純化的融合蛋白進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印，結(jié)果顯示融合蛋白MRP、HM6及GAPDH均可被豬鏈球菌2型HA9801株豬康復(fù)血清識(shí)別。
　　 根據(jù)豬鏈球菌2型mrp及hm6基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別獲取大小為531、9

4、64bp的mrp及hm6基因抗原性較強(qiáng)的片段，再通過(guò)重疊延伸的方法，將兩個(gè)基因通過(guò)一疏水性柔性多肽接頭（Gly4Ser）2堿基序列進(jìn)行前后拼接，構(gòu)建新的mrp-linker-hm6融合基因，克隆至pMD18-T Simple載體，經(jīng)測(cè)序分析表明插入片段長(zhǎng)度為1525bp，mrp、hm6及接頭拼接組合的順序，方向完全正確。將融合基因定向克隆至pET-28a（+）中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒mrp-hm6-pET28a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IP

5、TG誘導(dǎo)可表達(dá)分子量約為59.7kDa的融合蛋白MRP-HM6，免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果顯示MRP-HM6能與豬鏈球菌2型HA9801株豬康復(fù)血清反應(yīng)。根據(jù)豬鏈球菌2型HA9801株gapdh基因及上述mrp-linker-hm6基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別獲取gapdh基因和mrp-linker-hm6基因片段，應(yīng)用重組PCR技術(shù)將兩個(gè)片段通過(guò)一疏水性柔性多肽接頭（Gly4Ser）堿基序列進(jìn)行前后拼接，構(gòu)建新的gapdh-linker-mrp-li

6、nker-hm6融合基因，定向克隆至pET-28a（+），構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒gapdh-mrp-hm6-pET28a。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定后測(cè)序，結(jié)果表明插入片段長(zhǎng)度為2545bp，gapdh、mrp-linker-hm6及接頭拼接組合的順序、方向完全正確。將重組質(zhì)粒 gapdh-mrp-hm6-pET28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)分子量分別約為95.5kDa的融合蛋白GAPDH-MRP-HM6，純化后免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果

7、顯示該融合蛋白可被豬鏈球菌2型HA9801株豬康復(fù)血清識(shí)別。
　　 用復(fù)壯后的豬鏈球菌2型HA9801株通過(guò)腹腔注射斑馬魚(yú)，測(cè)定其對(duì)斑馬魚(yú)的半數(shù)致死量LD50為2.39x105CFU/尾。將350尾斑馬魚(yú)隨機(jī)分成7組，每組50尾，分別用50μg純化的MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6、GAPDH-MRP-HM6融合蛋白及1×107 CFU豬鏈球菌2型HA9801株全菌滅活苗免疫斑馬魚(yú)，首免14d后同樣劑量加強(qiáng)免疫一次，對(duì)

8、照組注射25μL滅菌PBS。二免后第14d用50LD50 HA9801株進(jìn)行攻擊，連續(xù)觀察7d。結(jié)果表明，對(duì)照組斑馬魚(yú)全部死亡，MRP、HM6、GAPDH，MRP-HM6及GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫組的相對(duì)保護(hù)率分別為38％、38％、32％、50％、48％，豬鏈球菌2型HA9801株全菌滅活苗組的相對(duì)保護(hù)率達(dá)到62％。以上結(jié)果表明，用MRP、HM6、GAPDH及其串聯(lián)原核表達(dá)產(chǎn)物免疫斑馬魚(yú)，可使其對(duì)同源菌株攻擊產(chǎn)生一定的保護(hù)