豬鏈球菌2型MRP和sspA抗原表位預測與表達及其免疫特性.pdf

1、本研究的目的在于獲得可抵御強毒豬鏈球菌2型(streptococcus suis type2，SS2)感染的保護性抗原肽，并分析其免疫特性，以期為研制低毒、高效的SS2蛋白亞單位疫苗提供科學依據。
　　 選取具有保護性或者具有重要免疫作用的蛋白——溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein，MRP)和枯草桿菌素樣蛋白酶(subtilisin-like serineprotease，sspA)。參考NC

2、BI蛋白質數據庫中MRP、sspA氨基酸序列和結構信息，避開蛋白的毒力結構域、舍棄信號肽段、去除膜錨定結構域和處于膜內(胞漿)的肽段。運用蛋白分析軟件ANTHEPROT5.0對蛋白的二級結構(螺旋、折疊、轉角、無規(guī)卷曲)和B細胞表位進行綜合預測與分析(親水性、疏水性、抗原性、跨膜結構、溶劑可及性等)，確定蛋白的B細胞優(yōu)勢表位簇。使用Oligo6.0和Primer5.0設計出兩端帶合適酶切位點的引物并通過PCR獲得預測的抗原肽段基因，酶切

3、連接插入原核表達載體pET32a，導入表達菌株BL21表達菌株，構建重組抗原的原核表達系統。IPTG誘導表達，以滲透性休克法和熱休克法純化重組蛋白；使用滅活SS2免疫血清Western blot檢測重組蛋白的免疫原性及其與SS2免疫血清的反應性。純化的重組蛋白免疫雌性SPF CD1小鼠檢測其安全性，用強毒SS2SDLVDU株攻毒重組蛋白免疫小鼠，評估重組蛋白的免疫保護效力。
　　 預測結果顯示MRP的950～1210aa肽段、s

4、spA的91～323aa肽段為B細胞優(yōu)勢表位簇。構建了上述肽段基因與pET32a的原核重組表達系統，重組蛋白可溶性表達，微量蛋白測定儀測定表達量為10 mg/mL；Western blot顯示重組蛋白具有良好的免疫原性和反應性；免疫安全性試驗表明，MRP和sspA重組蛋白均安全可靠；免疫效力試驗表明，MRP的950～1210aa肽段重組蛋白對小鼠的免疫保護率為40%，為菌體免疫所提供保護率的50%；sspA的91～323aa肽段重組蛋白